Nghiên cứu thử nghiệm xây dựng quy trình xác định nồng độ axit S-phenylmercapturic trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ.

25/09/2018

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Benzen là dung môi hữu cơ đã bị cấm sử dụng trong sản xuất công nghiệp từ lâu, vì nó có những tác hại nghiệm trọng đến sức khỏe của con người. Tuy nhiên, trong các dung môi hữu cơ được sử dụng thay thế cho benzen như toluen hoặc xylen... luôn chứa một lượng benzen nhất định có thể đến 5%[1]. Chính vì vậy người lao động làm việc trong một số môi trường lao động như điện tử, sản xuất sơn, da giày... dù ít hay nhiều vẫn phải tiếp xúc với benzen.Tại Việt Nam từ năm 1976 benzen đã được công nhận là yếu tố gây bệnh nghề nghiệp được bảo hiểm, từ 2006 đến nay chỉ số phenol niệu đã được sử dụng làm chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với benzen. Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy phenol là chỉ số giám sát chỉ có mối tương quan với benzen trong môi trường ở nồng độ cao khoảng trên 10 ppm, còn khi nồng độ benzen trong môi trường nhỏ hơn 10ppm thì phenol niệu không còn là chỉ số giám sát sinh học có tác dụng bảo vệ cho người lao động một cách tốt nhất[1],[2]. Theo quy định mới nhất về bệnh nghề nghiệp được hưởng bảo hiểm xã hội - Thông tư 15/2016/TT-BYT[3], thì chỉ số axit S-phenylmercapturic (SPMA) niệu là một trong những chỉ số giám sát sinh học được đề xuất xét nghiệm cho người lao động có tiếp xúc với benzen. Đây là một chỉ số giám sát sinh học cập nhật với xu hướng bảo vệ  sức khỏe người lao động trên thế giới, nhưng SPMA là chỉ số tương đối mới ở Việt Nam, do vậy phương pháp xác định chất này còn rất hạn chế, việc sử dụng chỉ số SPMA làm giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với bezen còn nhiều khó khăn. Theo hướng nghiên cứu của G. Marrubini[4] nhóm nghiên cứu đã tiến hành “Nghiên cứu thử nghiệm xây dựng quy trình xác định nồng độ axit S-phenylmercapturic trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ” với mục tiêu là: xây dựng quy trình xác định nồng độ axit S-phenylmercapturic trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ với độ chính xác trên 90%, giới hạn định lượng nhỏ hơn bằng 0.25µg/L.


2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Quy trình phân tích axit S-phenylmercapturicniệu-chất chuyển hóa của benzen trong nước tiểu.

- Nước tiểu người lao động tiếp xúc với benzen

2.2.Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu

- Khảo sát thử nghiệm xây dựng quy trình trong phòng thí nghiệm Theo hướng nghiên cứu của G. Marrubini[4]

- Thực nghiệm ngoài hiện trường: lấy mẫu nước tiểu của người lao động tại nơi làm việc

2.2.2. Kỹ thuật thực hiện:

a. Xây dựng quy trình:

Thử nghiệm ứng dụng phương pháp phân tích sắc với các điều kiện:

- Thiết bị: Máy sắc kí khí khối phổ Agilent, Tủ âm sâu -800C, máy lắc…

- Dụng cụ: Các dụng cụ chuyên dùng như bình định mức, pipet, cột mao quản DB 5MS (30m*0.32 mm*0.3 um),…

- Hóa chất: axit S-phenylmercapturic,HCl, Chloroform, Etyl acetat, Methanol của Sigma.Phương pháp phân tích được xây dựng theo nghiên cứu của phương pháp của G. Marrubini[4].

b. Xác định sản phẩm chuyển hóa: xác định bằng quy trình xây dựng được trên máy Máy sắc kí khí khối phổ của Agilent.

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả xây dựng quy trình

3.1.1.Chuẩn hóa các điều kiện cho phép đo

Để chọn được các điều kiện tối ưu cho xây dựng quy trình, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát, đánh giávàthu được kết quả của từng điều kiện như dưới đây.

a) Hóa chất và dung dịch chuẩn

- Hóa chất: axit S-phenylmercapturic, HCl, Chloroform, Etyl acetat, Methanol của Sigma

- Dung dịch chuẩn: phaaxit S-phenylmercapturictrong methanol để được các nồng độ từ 10 – 1000 ug/l

b) Các thông số cài đặt trên máy GC

            Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát đối với từng thông số và thu được được các giá trị tối ưu. Tại các giá trị này kết quả của phép đo là tốt nhất. Giá trị của các thông số tối ưu cụ thể như sau:

Điều kiện GC

- Nhiệt độ Inlet 250oC

- Nhiệt độ detector 250oC

- Nhiệt độ oven: 120oC (giữ 2 phút) – (20oC/ phút) – 240oC (giữ 2 phút)

- Nhiệt độ Interface 250oC

- Tổng tốc độ dòng : 100ml/phút

- Chế độ bơm mẫu : không chia dòng

- Thể tích bơm mẫu: 1ul

Điều kiện MS

- Chế độ Ion hóa : EI

- Năng lượng ion hóa : 70eV

- Chạy chế độ SIM: phổ m/z : 124/253

3.1.2. Chọn các điều kiện lấy mẫu, xử lý mẫu để có dung dịch đo

a) Lấy mẫu

Mẫu nước tiểu được thu vào cuối ca của ngày làm việc cuối tuần. Thu từ 5 -10ml nước tiểu đựng vào ống thủy tinh có thể tích 15-20ml, loại ống chịu được điều kiện âm sâu (-800C). Bảo quản lạnh tại hiện trường, khi đưa về phòng thí nghiêm được bảo quản âm sâu trước khi phân tích, bảo quản không quá 2 tuần.

b) Xử lý mẫu

Mẫu được xử lý với nhiều điều kiện khác nhau và nhóm nghiêm cứu thu được điều kiện cho kết quả tốt nhất là quy trình xử lý mẫu như dưới đây:

Bước 1: Hút chính xác 1ml mẫu hoặc chuẩn vào ống 10ml

Bước 2: Thêm 0.2ml HCl 0.5N

Bước 3:Thêm 2ml etyl acetat

Bước 4: Lắc trong vòng 20 phút

Bước 5: Đem ly tâm ở 1500 vòng trong 4 phút

Bước 6: Chuyển lớp dung môi phía trên sang một ống thủy tinh khác

Bước 7: Hóa hơi ở 40oC

Bước 8: Sau đó hòa cặn với 1ml dung dịch dẫn xuất

Bước 9: Metyl hóa ở 60oC trong vòng 1 giờ

Bước 10: Làm lạnh về nhiệt độ phòng

Bước 11: Thêm 1ml chloroform

Bước 12:Thêm 2ml nước DDW

Bước 13: Lắc trong 2 phút

Bước 14: Đem ly tâm ở 1500 vòng trong 4 phút

Bước 15: Loại bỏ lớp trên

Bước 16: Bơm vào máy GC

3.1.3. Đánh giá các điều kiện của quy trình

a) Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 

Khảo sát khoảng tuyến tính

Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lượng đến giới hạn tuyến tính gọi là khoảng tuyến tính. Khoảng tuyến tính của mỗi nguyên tố phân tích ở mỗi vạch phổ khác nhau là khác nhau[5], [6].

Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của SPMAbằng cách: pha một dãy chuẩn của SPMAtrong phenol là :

1 ; 10 ; 50 ; 100 ; 200 ; 400 ; 600 ; 800 ; 1000 ; 1200 µg/l

Căn cứ vào kết quả thu được nhóm nghiên cứu nhận thấy khoảng tuyến tính phương pháp phân tích SPMAtrong nước tiểu là từ LOQ-1000µg/L. Khi phân tích mẫu nếu hàm lượng nguyên tố cần phân tích nằm ngoài khoảng tuyến thì phải làm giàu mẫu hoặc pha loãng mẫu để phân tích mới đảm bảo được độ chính xác của phép đo.

Xây dựng đường chuẩn

* Đường chuẩn

Từ kết quả khảo sát khoảng tuyến tính nhóm nghiên cứu sử dụng phần mềm minitab 17.0 để xây dựng đường chuẩn. Phương trình đường chuẩn của SPMAtrong nước tiểu được chỉ ra ở dưới đây:


* Đánh giá phương trình hồi quy của đường chuẩn

Theo kết quả thu được từ phần mềm minitab 17.0 phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn cho phân tích SPMA trong nước tiểu có dạng: y = (-0.309± 1.94) + (154.71± 3.46) x

Trong phương trình y = a + bx, trường hợp lý tưởng xảy ra khi a = 0. Thực tế các số liệu phân tích thường mắc sai số ngẫu nhiên luôn làm cho a ≠ 0. Nếu giá trị a ≠ 0 có nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích sẽ mắc sai số hệ thống.Vì vậy trước khi sử dụng đường chuẩn cho phân tích cần kiểm tra sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0.

Kiểm tra a với giá trị 0 theo tiêu chuẩn thống kê Fisher (chuẩn F)[5],[6].

Nếu Ftính< Fchuẩnthì sự sai khác giữa giá trị a và 0 không có ý nghĩa thống kê và ngược lại.Kết quả đánh giá cho thấy Ftính= 4.21 ;  Fchuẩn = F(0.95; 4;5) = 5.19  Tức là Ftính< Fchuẩn ở phương trình đường chuẩn phân tích SPMA trong nước tiểu. Có nghĩa là sự sai khác giữa giá trị a và 0 không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy phương pháp phân tích trên không mắc sai số hệ thống.

3.1.4. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Đối với sắc ký khí thì việc xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) dựa theo tỷ số tín hiệu/nhiễu đường nên là khá phổ biến[5],[6]. Nhóm nghiên cứu sử dụng cách này để tính LOD, LOQ bằng cách thêm một lượng chất chuẩn nhỏ dần vào mẫu trắng và tại nồng độ 0.25µg/L thu được tín hiệu cao gấp 3 lần so với tín hiệu đường nền. Như vậy theo phương pháp tính LOD dựa trên tỷ số tín hiệu/nhiễu nhóm nghiên cứu thu được LOD=0.25µg/L, LOQ=0.75µg/L.

Căn cứ vào kết quả thu được nhóm nghiên cứu nhận thấy trong quy trình phân tích SPMA trong mẫu nước có giới hạn phát hiện 0.25µg/L,  giới hạn định lượng là 0.75µg/L. Vậy khoảng tuyến tính của SPMAtrong quy trình phân tích SPMAniệu là (LOQNước tiểu– 1000)µg/L tương đương (0.75-1000)µg/L.

3.1.5. Đánh giá độ chính xác của phương pháp

Theo quan điểm của tiêu chuẩn quốc tế (ISO – 5725 1 - 6:1994) và tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 6910 1- 6:2005) độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua độ chụm và độ đúng[6].

- Độ chụm chỉ mức độ giao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình. 

- Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.

a) Kiểm tra độ chụm

Trong khuôn khổ đề tài nhóm nghiên cứu kiểm tra độ chụm bằng cách dùng mẫu thử thêm chuẩn - pha ba loại mẫu có nồng độ thêm chuẩn bằng giá trị gần điểm đầu, điểm giữa, điểm gần cuối của khoảng tuyến tính (tương đương với các mức nồng độ thấp, trung bình, cao). Mỗi mức nồng độ lặp lại 10 lần. Trên cơ sở kết quả các mẫu lặp lại nhóm nghiên cứu đánh giá độ thu hồi theo công thức sau:


Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần lặp lại.


Với kết quả thu được ở bảng 2 cho thấy CV% = 8.039% lớn nhất ở mức nồng độ nhỏ nhất năm trong khoảng cho phép của AOAC, từ 10 -100µg/L CV% cho phép là 15-21%[6]. Nên những sai số ở trên cả điểm đầu, điểm cuối hay điểm giữa của khoảng tuyến tính đều là những sai số nhỏ và chấp nhận được. Điều đó chứng tỏ độ chụm của phương pháp đạt yêu cầu.

b) Kiểm tra độ đúng

Để đánh giá độ đúng của phương pháp nhóm nghiên cứu đã chọn cách mà hiện nay được sử dụng phổ biến nhất trên thế giới là dùng vật liệu chuẩn (còn gọi là mẫu chuẩn).Mẫu chuẩn là mẫu phân tích có hàm lượng đã được xác định trước và đúng.Có nhiều cấp vật liệu chuẩn khác nhau, trong đó cao nhất là CRM (certified reference materials - mẫu chuẩn được chứng nhận) được cung cấp bởi các tổ chức có uy tín trên thế giới (RECIPE – của Đức). Kết quả phân tích mẫu CRM thể hiện qua bảng sau:


Từ bảng 2 ở trên nhóm nghiên cứu nhận thấy kết quả phân tích mẫu CRM cho các giá trị nằm trong khoảng giá trị đã cho và sát với giá trị trung bình của mẫu CRM. Ở mức nồng độ thấp của mẫu nước tiểu giá trị thu được là 4.42µg/L xấp xỉ giá trị trung bình của mẫu CRM (4.86µg/L) và thuộc khoảng giá trị đã cho là (3.65 - 6.08) µg/L. Tương tự, ở mức nồng độ cao giá trị thu được 40.89µg/L,nằm trong khoảng cho phép (34.2 – 51.2)µg/L và gần với giá trịnh trung bình 42.7µg/L. Điều đó chứng tỏ phương pháp phân tích đảm bảo độ đúng.

Như vậy, qua việc đánh giá những tiêu chí cần thiết cho một quy trình phân tích, nhóm nghiên cứu nhận thấy quy trình phân tích SPMA trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ là đạt yêu cầu của một quy trình phân tích.

Từ quy trình trên nhóm nghiên cứu có một số nhận xét như sau:

Quy trình của nhóm nghiên cứu có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thu được tốt hơn nhiều so với phương pháp phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Như phương pháp của (2014)[7] có giới hạn định lượng kém hơn phương pháp của nhóm nghiên cứu nhiều lần: (LOD/LOQ) của nhóm nghiên cứu là 0.25/0.75µg/L của D. A. Purwanto là (0.7832 ± 0.0329)/(2.6108 ± 0.0940) µg/mL. Với giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng trong nghiên cứu của D. A. Purwanto có phần hạn chế khi phân tích SPMA với lượng mẫu nhỏ.Tuy nhiên đây cũng là hạn chế của thiết bị mà D. A. Purwanto lựa chọn vì HPLC có ngưỡng phát hiện kém hơn so với GC/MS. So với phương pháp 8326 của NIOSH có LODlà 0.2 µg/L, có khoảng tuyến tính từ0.5-50µg/L[8], kết quả nghiên cứu của nhóm nghiên cứu cho thấy LOD của nhóm nghiên cứu cũng tương đương, trong khi khoảng tuyến tính của nhóm nghiên cứu rộng hơn là từ (0.75-1000)µg/L so với khoảng tuyến tính của phương pháp 8326 NIOSH hay phương pháp của D. A. Purwanto[7]. Điều này cho thấy sự thuận tiện trong phân tích mẫu, không phải pha loẵng mẫu nhiều lần. Mặc dù giới hạn phát hiện có kém hơn phương pháp 8326 - NIOSH một chút.Tuy nhiên phương pháp 8326 - NIOSH sử dụng thiết bị LC/MS/MS. Đây là thiết bị rất đắt tiền độ nhạy cao gấp nhiều lần thiết bị MG/MS mà nhóm tác giả sử dụng. Bên cạnh đó phương pháp 8326 - NIOSH sử dụng phương pháp chiết pha rắn. Phương pháp này rất tốn kém vì chi phí xử lý mẫu có sử dụng cột chiết.Điều này cho thấy phương pháp nhóm tác giả đã áp dụng rất thuận tiện cho việc phân tích mẫu hàng loạt, giám sát cho người lao động có tiếp xúc với benzene.

Quy trình này có thể ứng dựng trên các máy thế hệ tương đương hoặc thế hệ tiếp theo của hãng. Đối với những hãng khác chỉ cần là những máy có điều kiện và tính năng kỹ thuật tương tự (ứng dụng) nếu hiện đại hơn thì càng tốt đều có thể dùng được.

3.2. Kết quả xác định chất chuyển hóa

            Để ứng dụng quy trình phân tích xác định chất chuyển hóa SPMA trong nước tiểu, nhóm nghiên cứu lấy 200 mẫu nước tiểu của người lao động không tiếp xúc với dung môi hữu cơ kết quả cho thấy :


Kết quả bảng 3 cho thấy: Trong 200 đối tượng người lao động không tiếp xúc với benzene được lấy nước tiểu xét nghiệm nồng độ SPMA niệu thì có đối tượng không phát hiện(20%), cũng có 80% đối tượng phát hiện nồng độ SPMA với nồng độ trung bình 1.28±2.82(µg/L) nằm trong tiêu chuẩn cho phép (≤ 25µg/gcreatinine)[2],[3]. Từ kết quả trên nhóm nghiên cứu nhận thấy đối với người lao động không tiếp xúc với benzene thì nồng độ SPMA niệu tương đối thấp. Đây cũng là số liệu khảo sát ban đầu về nồng độ SPMA của người Việt Nam không tiếp xúc với benzene làm cơ sở so sánh cho những nghiên cứu khác.

Sau khi sử dụng quy trình xây dựng được để phân tích mẫu thực, nhóm nghiên cứu nhận thấy quy trình ổn định, đảm bảo kết quả chính xác. Chính vì vậy quy trình dự thảo ban đầu không cần thay đổi gì sau khi nhóm nghiên cứu áp dụng thực tế.

4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

* Thử nghiệm được những tiêu chí cần thiết cho một quy trình phân tích SPMA trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ là đạt yêu cầu của một quy trình phân tích, cụ thể như sau:

- Khoảng tuyến tính: (0.75 -1200) µg/L.

- Giới hạn phát hiện: 0.25 µg/L

- Giới hạn định lượng: 0.75 µg/L

- Quy trình đảm bảo tính ổn định, độ chính xác trên 90%.

- Giới hạn phát hiện LOD, LOQ tương đương và thấp hơn một số tác giả khác đã nghiên cứu

* Áp dụng quy trình đã xây dựng được  trên 200 mẫu nước tiểu của 200 đối tượng người lao động không tiếp xúc với benzene cho thấy nồng độ trung bình của SPMA 1,28±2,82 (µg/gcreatinen) thấp hơn giới hạn cho phép.

4.2. Kiến nghị

     Cần áp dụng rộng rãi kỹ thuật xác định SPMA trong nước tiểu để làm công cụ giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với benzen.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001), "Benzene. In: Documentation of the Threshold Limit Vales and Biological Exposure Indices".

[2]. American Conference of Industrial Hygienists, Threshold Limit Value for Chemical Substances and Physical Agents and Biological Exposure Indices. 2016, p. 250.

[3]. Bộ y tế. (2016), "Thông tư 15/2016/TT-BYT ngày 1/7/2016 quy định về bệnh nghề nghiệp được hưởng bảo hiểm xã hội".

[4]. G Marrubini, S Dugheri, M Pacenti et al. (2005), "Determination of S-phenylmercapturic acid by GC-MS and ELISA: a comparison of the two methods", Biomarkers, vol. 10, no. 4, pp. 238-251.

[5]. Tạ Thị Thảo,  Thống kê trong hóa phân tích. Giáo trình môn học,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia Hà Nôi: , 2010.

[6]. Viện kiểm nghiện an toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia, Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật học. NXB Khoa học và Kỹ Thuật, 2010.

[7]. Purwanto D A, Primaiharinastiti R. PI RIESTA, Annuryanti. F,. (2014), "Development and validation of HPLC method for determination of Sphenylmercapturic acid (S-PNA)in urine ", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6 (5): 305, vol. 308.

[8]. Clayton B’Hymer. (2014), " Method 8326 S-Benzylmercapturic acid and S-phenylmercapturic acid in urine, NIOSH Manual of Analytical Methods (NMAM), Fifth Edition".

ThS. Vũ Xuân Trung, ThS. Nguyễn Thị Hiền, Tống Thị Ngân

Lê Thị Thu Cúc, Nguyễn Thị Thanh Huyền, Lưu Phi Long, Mai Ngọc Thanh

Viện Khoa học An toàn và Vệ sinh lao động

(Nguồn tin: Vnniosh.vn)