Nghiên cứu phân lập và định danh nấm Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin trong không khí môi trường lao động tại nhà máy xay xát gạo ở Hưng Yên

19/12/2019
Bài báo giới thiệu phương pháp phân lập định danh những nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin. Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) Aflatoxin là một trong những độc tố có nguy cơ gây ung thư lớn nhất hiện nay. Nấm sinh Aflatoxin chủ yếu Aspergillus spp, nghiên cứu phân lập nhóm nấm Aspergillus ssp trong không khí nhà máy xay xát gạo tại Hưng Yên. Lấy mẫu nấm trong không khí bằng phương pháp chủ động, phương pháp định danh nấm bằng hình thái học, kết hợp với phương pháp sinh học phân tử để khẳng định chúng, xác định chủng loại nấm sinh độc tố. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được chủng nấm có đặc điểm hình thái tương tự Aspergillus spp, qua kết quả giải trình tự gen bằng đoạn mồi ITS đã khẳng định những nấm mốc phân lập được là Aspergillus flavus, đấy chính là chủng loại nấm sinh độc tố Aflatoxin.

I. Giới thiệu về nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin     

 của ,Bào tử nấm có kích thước nằm trong khoảng 2÷ 10 µm chúng phát tán rất dễ dàng trong không khí; và chủng nấm Aspergillus sp bào tử có kích thước 2,14 ÷ 3,5µm. Vkích thước này nằm trong vùng có nguy cơ cao về hạt có thể đi thẳng vào phế nang phổi  [1], [2].

      

Hình 1: Tiếp xúc nấm mốc trong không khí và cơ chế xâm nhập vào cơ thể người

Theo CDC, nấm mốc thông thường hình thành sợi và bào tử đính, nhưng khi bào tử nấm mốc với kích thước 2÷3,5 µm sẽ đi thẳng vào phổi, bộ phận khác của cơ thể người; chúng phản ứng với nhiệt độ cơ thể 37oC biến thành một loại men có thể nhân số lượng lớn bên trong phổi hoặc tạo ra các enzym, protein độc tố tác động đến tế bào của cơ thể.

Độc tố Aflatoxin có tên từ nấm mốc sinh ra chúng. Aflatoxin là viết tắt của Aspergillus flavus toxins, ký hiệu “B” vì chúng phát huỳnh quang màu xanh (blue) dưới tia UV; ký hiệu “G” vì cho màu xanh lục (green) dưới ánh sáng tia UV, ký hiệu “M” được tìm thấy trong sữa của bò cái do ăn thức ăn bị nhiễm aflatoxin. Aflatoxin là chất độc được sản sinh ra như một chất chuyển hoá trong quá trình trao đổi chất của nấm mốc Aspergillus flavusAspergillus parasiticus trong thực phẩm và thức ăn gia súc. Aflatoxin là độc tố tích luỹ trong cơ thể người và gia súc, là nguồn gây ung thư mạnh (nhất là ung thư gan và tổn thương ở thận) [3], [4], [5], [6].


Hình 2: Cấu trúc độc tố Aflatoxin

Hiện nay, đã phát hiện khoảng gần 20 loại aflatoxin khác nhau: Aflatoxin được ký hiệu B1, B2, B2a, B3, G1, G2a, M1, GM2, P1, Q1, RO, RB1, RB2, AFL, AFLH, AFLM … và những chất bắt nguồn từ methoxy, ethoxy và acetoxy. Tuy nhiên chỉ một số ít trong chúng được ghi nhận là hợp chất xuất hiện trong tự nhiên, các chất còn lại được sản sinh trong quá trình trao đổi chất hoặc là các dẫn xuất. Hợp chất quan trọng là Aflatoxin B1 và sau B1 tìm thấy trong các sản phẩm nông nghiệp là aflatoxin M1, [4]. Trong đó aflatoxin B1 có độc tính gây ung thư mạnh nhất; độc tố của aflatoxin B1 độc hơn xyanua kali tới 10 lần và hơn Asen tới 68 lần [7];  [8].

Những nấm mốc sinh độc tố được phát hiện nhiều trong thực phẩm và một số dược liệu, thuốc nam, gạo, đậu tương, lạc chủ yếu là các chủng loại Aspergillus spp. Chúng sinh độc tố mycotoxin. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện những chủng nấm Aspergillus flavus  hay Aspergillus paraticus sinh độc tố Aflatoxin B1, B2, G1, G2 . Độc tố Aflatoxin B1 là nguy hiểm nhất hiện nay nó còn nguy hiểm hơn so với một số các chất độc phổ biến khácSusana Viegas et al. (Celine M. O’GORMAN, 2011) [9].

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Nấm mốc Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin phân lập được trong không khí môi trường lao động tại một số nhà máy xay xát thóc và gạo khu vực Hưng Yên.

2.2. Môi trường nuôi cấy

Trong nghiên cứu này sử dụng các môi trường chọn lọc là ADM, CAM, DG-18 chủng nấm Aspergillus spp sinh độc tố của các nghiên cứu trên thế giới về những nấm mốc Aspergillus spp sinh độc tố A. flavus và A. parasiticus đã được công bố và một số môi trường đã được tiêu chuẩn hóa về phát hiện nấm mốc trong không khí.

Thành phần môi trường CAM (g/L): Coconut 200 ml; thạch 20; nước cất 1.000 ml; pH 6,8 ÷ 7,0;  khử trùng 121oC, 15 phút.

Thành phần môi trường Czapek dox (g/L): Peptone 5,0; Saccarose 30; NaNO3 2,0; K2HPO4 1,0; MgSO4 0,5; KCl 0,5; thạch 20; nước cất 1000 ml; pH 4,5 ÷ 5,5,  khử trùng 121oC, 15 phút.

Thành phần môi trường ADM (g/L): Peptone10; Yeast extract20 ;Ferric ammonium citrate: 0,50; Dichloran 0,002; thạch 20;1 đơn vị kháng sinh clorifamicyl nước cất 1000 ml; pH 6,8 ÷ 7,0,  khử trùng 121oC, 15 phút

Môi trường DG-18 (g/L): Pepton: 5,0; KH2PO4: 1,0; K2HPO4: 1,5; MgSO4:0,5; Dichloran 0,002: 0,5; glucose: 10 g; Glycerol: 0,1; Cloramphenicol: 0,1;thạch 15;pH 5,6± 0,2 khử trùng 121oC, 15 phút.

Môi trường được thực hiện quy chuẩn theo quy trình QC/QA đảm bảo chất lượng môi trường thí nghiệm. Điều kiện nuôi cấy ở 28±0,5oC với thời gian môi tả hình thái học và giải trình tự gen từ 3÷7 ngày

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: lấy mẫu trực tiếp môi trường lao động, sử dụng môi trường chọn lọc nấm Aspergillus spp có nguy cơ sinh độc tố. Lấy mẫu nấm Aspergillus spp trong không khí bằng thiết bị SpinAir với tốc độ lấy mẫu là 100 lít/phút theo TCVN 10736-18:2017 (ISO 16000-18:2011); môi trường nuôi cấy theo TCVN 10736-17:2017 (ISO 16000-17: 2011) và một số nghiên cứu từ nước ngoài đã công bố phương pháp định danh, phân lập nấm mốc sinh độc tố trong thực phẩm và trong không khí khu vực làm việc.

Phân lập định danh nấm Aspergillus spp bằng hình thái học theo phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và Bùi Xuân Đồng. Định danh dùng khóa khóa phân loại Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Đặng Vũ Hồng Miên. Xác định nấm mốc sinh độc tố cơ bản bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, đánh giá khả năng phát huỳnh quang của các độc tố Aflatoxin trên môi trường ADM, CAM khi chiếu đèn UV 365nm, aflatoxin sẽ phát huỳnh quang. Qua màu sắc phát quang xác định được chủng nấm mốc sinh ra Aflatoxin khác nhau. Định danh bằng cách giải trình tự gen các chủng nấm mốc đã được mô tả hình thái học, dùng phương pháp xử lý số liệu Mega 7.0 và blast search so sánh trình tự gen trên Gen bank khẳng định chủng loại đã nấm phân lập được trong không khí tại chế biến, xay xát Gạo Hưng Yên.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Mẫu được lấy tại các vị trí ở một số cơ sở chế biến, xay xát Gạo tại Hưng Yên. Mỗi vị trí lấy mẫu được lặp lại 5 lần trên mỗi loại môi trường chọn lọc. Đĩa thạch nuôi ủ điều kiện nhiệt độ 28±0,5ºC trong thời gian từ 3÷7 ngày. Mô tả hình thái học và định danh chủng nấm mốc ngày thứ 5 từ khi bắt đầu lấy mẫu.

Kết quả nấm mốc Aspergillus spp được xác định trên môi trường chọn lọc lấy tại hiện trường, với tổng số 20 mẫu tại bốn vị trí là nạp liệu (thóc), máy xay xát, máy chuỗi bóng, đóng bao.

Bảng 1. Kết quả số lượng nấm có nguy cơ sinh độc tố tại cơ sở chế biến gạo

Ký hiệu

Vị trí lấy mẫu

Môi trường lấy mẫu

Nấm Aspergillus sp

 (CFU/m3)± SD

VT1

Nạp liệu (thóc)

ADM,DG18

228 ± 29

VT2

Máy xay xát

ADM,DG18

276 ± 23

VT3

Máy chuỗi bóng

ADM, DG18

230 ± 37

VT4

Đóng gói

ADM, DG18

180 ± 41


Kết quả sau khi lấy mẫu tại khu vực làm việc được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và đánh dấu những khuẩn lạc có đặc điểm hình thái học giống nhau, kết quả chủng loại nấm Aspergillus spp sinh độc tố được định danh đếm và tính toán số lượng quy về trên một đơn vị m3 không khí.

Trong khuôn khổ nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã tìm ra những chủng nấm mốc có nguy cơ sinh độc tố ảnh hưởng đến sức khỏe người lao động khi tiếp xúc phải, xây dựng cơ sở dữ liệu khoa học nghiên cứu bệnh nghề nghiệp liên quan tới tiếp xúc yếu tố sinh học trong môi trường lao động.

           


Hình 3. a: Hình ảnh lấy mẫu lặp lại 5 lần; b: mặt trước khuẩn lạc chủng đã phân lập thuần nhất; c: mặt sau khuẩn lạc chủng đã phân lập thuần nhất

Trong Hình 3a lấy mẫu lặp lại tại mỗi vị trí những chủng nấm mốc Aspergillus spp chủng nấm biến đổi sắc tố môi trường, khuẩn lạc có đặc điểm của chủng loại nấm được mô tả của những nghiên cứu đã công bố của Đặng Vũ Hồng Miên, Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Lân Dũng và các cộng sự đã định danh. Trong nghiên cứu này thực hiện lấy mẫu trong không khí trong môi trường lao động sau đó thuần nhất các khuẩn lạc có nghi ngờ là những chủng sinh độc tố riêng biệt, cấy khuẩn lạc trên các môi trường khác nhau như: Czapek dox, DG-18, ADM, CAM để mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái sợi nấm và bào tử để định danh. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh học cụ thể được tổng kết ở bảng dưới đây.

Bảng 2. Đặc điểm hình thái sinh học của nấm sinh độc tố tại cơ sở chế biến gạo

  1. Nguồn gốc:

Cơ sở chế biến và sản xuất gạo tại Hưng Yên

  1. Nhiệt độ:

28 ±1oC

  1. Ánh sáng:

Bình thường

  1. Môi trường:

Czapek

  1. Tuổi nấm khi phân loại:

Sau 7 ngày

  1. Khuẩn lạc:


Tốc độ mọc:           

Trungbình, Kích thước: 5,0÷5,5 cm

Dạng khuẩn lạc:

Dạng nhung hoặc dạng hạt rời

Giọt tiết:

Xung quanh rìa khuẩn lạc đều có giọt tiết màu trắng trong. Chúng được tiết ra sau 4÷5 ngày nuôi cấy

Màu sắc:


Mặt phải

Ban đầu khuẩn lạc có màu xanh nhạt sau chuyển sang màu xanh lục, bề mặt khuẩn lạc có các khía hình ngôi sao.

Mặttrái                             

Mặt sau có màu nâu vàng và cóa các vết nhăn hình sao.

Sắc tố ra môi trường:

Không

  1. Giai đoạn vô tính:

Đầu:

Cách sắp xếp:

Mọc từ môi trường

Hình dạng:

Hình cầu, toả tia khi non và tạo thành các cột với những chuỗi bào tử rất dài khi già

Kích thước:

(50÷200)µm

Cuống:

Hình dạng:

Bề mặt cuống ráp, có nhiều gai mịn, đều.

Kích thước:

(380÷800) x (12÷18)µm

Màu sắc:

Không màu.

Bọng:

Hình dạng:

Hình cầu đến gần cầu

Kích thước:

(35÷50)µm

Vùng sinh sản:

Khắp mặt bọng

Thể bình:

Cách sắp xếp:

Thể bình hai tầng và một tầng. Có cả hai loại thể

bình trên cùng một bông

Lớp 1: Hình dạng:

Kích thước:

Hình trụ

(10÷20) x (3,75÷5)µm

Lớp 2: Hình dạng:

Kích thước:

Hình chai

(5÷7,5) x (3,75÷5)µm

Bào tử:

Hình dạng:

Kích thước

Hình cầu, bề mặt có vẻ trơn nhẵn (3÷5)µm

  1. Giai đoạn hữu tính:

Thể quả

Thể quả


Bào tử túi

Hình dạng:

Kích thước:

Hình cầu, gần cầu, có gai xù xì

3÷5µm


           Kết quả quan sát vi thể là quan sát các bào tử của chủng nấm Aspergillus spp, hình ảnh dưới đây được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) JSM-5410LV tại Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh.


Hình 4. Hình thái bào tử của chủng nấm Aspergillus spp

Hình 4 ở trên cho thấy đầu mọc từ cơ chất, hình cầu, hình tỏa tia hoặc hình xé rách kích thước 75÷275µm, cuống không màu xù xì có kích thước 150÷1125 x 15÷19µm, bọng hình gần cầu đến chùy có kích thước  21÷45 x 27 ÷50µm, có 2 loại thể bình lớp 1 và lớp 2, bào tử hình cầu có gai rõ có kích thước  4÷7,5µm, đặc điểm hình thái gần trùng hợp chủng Aspergillus flavus được mô tả trong cuốn sách “Illustrated genera of Imperferfect fungi” và “Colour atlas of diagnotic microbiology”, các mô tả của Bùi Xuân Đồng, Đặng Vũ Hồng Miên.

Nghiên cứu lựa chọn ngẫu nhiên một số chủng đã phân lập được trong quá tình lấy mẫu dùng giải trình tự Gen định danh chính xác chủng nấm mốc đã phân lập được là Aspergillus flavus. Giải trình tự gen nấm mốc sử dụng đoạn mồi gen đoạn ITS1 và ITS4 phản ứng PCR nhân đoạn gen, đoạn gen này có mặt trong tất cả các tế bào, có chứa vùng bảo thủ cao và vùng biến đổi cho phép phân biệt giữa các chủng loại khác nhau trong giới nấm mốc rất dễ dàng. Kết quả giải trình tự và phân tích gen ở trên cho thấy chủng A. flavus HY.9 và A. flavus T4.1 lựa chọn có trình tự gen tương đồng với các chủng A. flavus trên ngân hàng Gen là 100% cụ thể danh sách các chủng được thể hiện như bảng dưới đây.

Mã số trên ngân hàng Gen

Thông tin chủng

% tương đồng

CP044617.1

Aspergillus flavus NRRL 3357

100

MH279385.1

Aspergillus flavus DTO 067-I8

100

JF951750.1

Aspergillus flavus F4

100

MH279408.1

Aspergillus flavus DTO 213-I2

100


Qua bảng so sánh ở trên có thể khẳng định chính xác chủng đã phân lập được trong không khí tại nhà máy xay xát Gạo Hưng Yên đều là chủng Aspergillus flavus. Đây là chủng nấm có khả năng sinh độc tố Aflatoxin.

IV.  Xác định nấm mốc sinh độc tố

            Cấy mẫu chủng nấm mốc A. flavus lên trên môi trường CAM hoặc ADM nuôi cấy trong điều kiện 28o± 0,5oC thời gian 5÷7 ngày, đặt trên đèn chiếu UV 365nm quan sát khả năng phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc, xác định chủng nấm mốc này có sinh ra độc tố Aflatoxin trên môi trường chọn lọc không. (Hình 5)


            Hình 5: Quan sát vòng phát huỳnh quang trên đèn UV 365mm

Những nấm lấy mẫu ở khu vực làm việc tại cơ sở chế biến Gạo có khả năng sinh ra Aflatoxin, số lượng nấm có nguy cơ sinh độc tố (Bảng 1) trong không khí người lao động tiếp xúc phải sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe. Theo WHO giới hạn cho phép tổng nấm mốc các loại trong không khí ở các khu vực trong nhà là 500CFU/m3 và không chấp nhận mức trên 50CFU/m3 đối với từng chủng loại có nguy cơ gây bệnh và nguy hiểm cho người. Còn đối với một số các tổ chức khác như EU tiêu chuẩn tiếp xúc được cho là sạch, có nguy có thấp nhất là dưới 50CFU/m3 không khí. Nhưng vậy không khí tại các khu vực làm việc trong các cơ sở chế biến Gạo chứa nhiều nguy cơ tiềm ẩn ảnh hưởng đến sức khỏe người lao động.

            Theo khuyến cáo của WHO và tổ chức ung thư quốc tế đều chỉ ra rằng độc tố aflatoxin được xếp vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người, tổn thương đến gan, thận, mật. Gây ngộ độc cấp tính với các triệu chứng gồm sự xuất huyết; hủy hoại gan; thay đổi đường tiêu hóa, hấp thu các sản phẩm trao đổi chất và chết. Ngộ độc mãn tính với những biểu hiện bệnh như sự chuyển hóa thức ăn yếu, tỉ lệ tăng trưởng thấp... Bên cạnh đó Aflatoxin cũng làm giảm khả năng tiết sữa, đẻ trứng và sức đề kháng ở gia súc, gia cầm. Đối với bệnh nhân suy giảm miễn dịch, chúng phá hủy các cơ quan trong cơ thể như thận, gan, viêm phổi, hen xuyễn, viêm dạ dày.

Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả mới dừng ở việc xác định được chủng nấm có nguy có sinh độc tố Aflatoxin, đây chính là  nguồn tiềm ẩn rủi ro ảnh hưởng đến sức khỏe người lao động. Để nghiên cứu sâu hơn về xác định cơ chế sinh độc tố và cơ chế gây bệnh của những chủng loại nấm mốc này cần có nhiều những nghiên cứu chuyên sâu khác, như xác định được gen sinh Aflatoxin và gen sinh các hoạt chất sinh học khác, khả năng xâm nhập vào cơ thể gây bệnh. Tuy nhiên nghiên cứu này cung cấp được cơ sở khoa học nghiên cứu, đánh giá rủi do tiếp xúc chủng loại nấm gây hại trong môi trường lao động; là cơ sở khoa học để người sử dụng lao động có biện pháp cải thiện điều kiện làm việc và có những biện pháp phòng tránh, giảm nguy cơ gây bệnh nghề nghiệp.

V. KẾT LUẬN

Đã phân lập được chủng nấm mốc có đặc điểm khuẩn lạc đặc trưng của chủng nấm Aspergillus spp trong không khí môi trường lao động tại cơ sở chế biến, xay xát gạo ở Hưng Yên. Quan sát đặc điểm sinh học đại thể và vi thể trên môi trường chọn lọc chung nấm mốc sinh độc tố và giải trình tự gen khẳng định chính xác, định danh được chủng nấm Aspergillus flavus sinh độc tố có trong không khí khu vực làm việc.

Kết quả nghiên cứu này đã giải được trình tự gen của hai chủng nấm mốc này với trình tự nucleotid ITS1 5,8S ITS4, so sánh trên Gen bank chủng Aspergillus HY.9 và Aspergillus T4.1 cho độ tương đồng 100% với chủng Aspergillus flavus trên ngân hàng gen. Đây là chủng loại nấm mốc có khả năng sinh độc tố Aflatoxin. Độc tố này là một trong những loại độc tố đã được khuyến cáo rất nhiều hiện nay trong thực phẩm. Theo khuyến cáo của tổ chức WHO và tổ chức ung thư quốc tế độc tố aflatoxin được xếp vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người, tổn thương đến gan, thận, mật, gây ngộ độc cấp tính với các triệu chứng xuất huyết và hủy hoại gan, thay đổi đường tiêu hóa, hấp thu các sản phẩm trao đổi chất và có thể dẫn đến tử vong. Ngoài ra chủng nấm này cũng nằm trong nhóm chiếm đến 90% nguy cơ gây ra bệnh viêm xoang, bệnh nấm phổi.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1].       Yamamoto N., Bibby K., Qian J. và cộng sự. (2012). "Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air". ISME J, 6(10), 1801–1811.

[2].       Madsen A.M., Larsen S.T., Koponen I.K. và cộng sự. (2016). "Generation and Characterization of Indoor Fungal Aerosols for Inhalation Studies". Appl Environ Microbiol, 82(8), 2479–2493.

[3].       Abbas H.K., Shier W.T., Horn B.W. và cộng sự. (2004). "Cultural Methods for Aflatoxin Detection". J Toxicol Toxin Rev, 23(2–3), 295–315.

[4].       Andrade P.D., da Silva J.L.G., và Caldas E.D. (2013). "Simultaneous analysis of aflatoxins B1, B2, G1, G2, M1 and ochratoxin A in breast milk by high-performance liquid chromatography/fluorescence after liquid–liquid extraction with low temperature purification (LLE–LTP)". J Chromatogr A, 1304, 61–68.

[5].       Caceres I., El Khoury R., Bailly S. và cộng sự. (2017). "Piperine inhibits aflatoxin B1 production in Aspergillus flavus by modulating fungal oxidative stress response". Fungal Genet Biol, 107, 77–85.

[6].       Đào T.T.X., Lê Q.H.(2006), "Xây dựng phương pháp xác định nhanh các chủng nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR", Bộ Giáo dục và đào tạo. Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.

[7].       Alshannaq A. và Yu J.-H. (2017). "Occurrence, Toxicity, and Analysis of Major Mycotoxins in Food". Int J Environ Res Public Health, 14(6), 632.

[8].       Faria C.B., Santos F.C. dos, Castro F.F. de và cộng sự. (2017). "Occurrence of toxigenic Aspergillus flavus in commercial Bulgur wheat". Food Sci Technol, 37(1), 103–111.

[9].       O’Gorman C.M. (2011). "Airborne Aspergillus fumigatus conidia: a risk factor for aspergillosis". Fungal Biol Rev, 25(3), 151–157.

Vũ Duy Thanh

Viện Khoa học An toàn và vệ sinh lao động, Tổng Liên đoàn lao động Việt Nam


(Nguồn tin: Vnniosh.vn)