Xây dựng kỹ thuật định lượng Methyl Ethyl Keton trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ

30/09/2020

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Methyl Ethyl Keton (MEK) là dung môi thuộc nhóm keton – nhóm chất gây bệnh nghề nghiệp được bảo hiểm (theo ILO - 2010)[3]. Theo khảo sát ban đầu cho thấy người lao động làm việc trong các cơ sở sản xuất da giày có tiếp xúc MEK ở nồng độ tương đối cao (nhiều vị trí làm việc có nồng độ của MEK cao hơn tiêu chuẩn cho phép (>150mg/m3). Theo Hiệp hội các nhà vệ sinh công nghiệp Mỹ (ACGIH - 2018)[4],[5], nồng độ MEK trong nước tiểu được sử dụng làm tiêu chuẩn giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với MEK trong môi trường lao động.

Trên thế giới đã có các phương pháp nghien cứu quy trình kỹ thuật phân tích Methyl Ethyl Keton (MEK) như: phương pháp của 8319 của NIOSH[6] ; Nghiên cứu của Michitsuji H. và cộng sự(1992) [7], nghiên cứu của tác giả Chou J. S. và cộng sự[9]

Tại Việt Nam, mặc dù người lao động đang tiếp xúc với MEK vượt tiêu chuẩn cho phép, nhưng chưa cóquy trình kỹ thuật định lượng Methyl Ethyl Keton trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ dể giám sát chỉ số sinh học cho người lao động có tiếp xúc với chất này. Vì vậy, chúng tôi tiến thực hiện nghiên cứu “Xây dựng quy trình kỹ thuật đinh lượngMethyl Ethyl Keton trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ”. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu là: xây dựng được quy trình phân tích MEK trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ với độ chính xác trên 97%, giới hạn định lượng 0,01µg/mL, và đề xuất ứng dụng vào việc nghiên cứu tiêu chuẩn giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với MnBK.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Xây dựng quy trình phân tích MEKtrong nước tiểu của người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp.

     -  Nước tiểu của 56 người lao động tiếp xúc với MnBK

     -  Xây dựng quy trình dựa theo tài liệu của Laboratory Procedure Manual - The Centers for Disease Control and Prevention (8319-2014)[6]với các điều kiện cơ bản như: nhiệt độ cột, nhiệt độ detector…

2.2. Phương pháp nghiên cứu 

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

Thử nghiệm xây dựng quy trình trong phòng thí nghiệm, kết hợp với điều tra cắt ngang người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với MnBK.

2.2.2. Phương pháp kỹ thuật nghiên cứu

 - Phương pháp phân tích được xây dựng dựa theo tài liệu của Laboratory Procedure Manual - The Centers for Disease Control and Prevention (8318-2014)[8] với các điều kiện cơ bản như: nhiệt độ cột, nhiệt độ detector…

- Lấy mẫu ngoài hiện trường: lấy mẫu nước tiểu của người lao động tại nơi làm việc

- Khảo sát, thử nghiệm và xây dựng quy trình kỹ thuật xét nghiệm trong phòng thí nghiệm Viện Khoa học An toàn và Vệ sinh lao động Việt Nam

a. Thử nghiệm xây dựng quy trình kỹ thuật :

Thử nghiệm ứng dụng phương pháp phân tích sắc với các điều kiện:

- Thiết bị: Máy sắc kí khí khối phổGC/MS (G3440A-GC7890A của Agilent), tủ âm 800C…

- Dụng cụ: Các dụng cụ chuyên dùng như bình định mức, pipet, Cột DB1-MS của Agilent

- Hóa chất: MEK; Methanol; NaClcủa hãng Sigma đảm bảo độ tinh khiết để phân tích lượng vết

Phương pháp phân tích được xây dựng theo tài liệu của Laboratory Procedure Manual - The Centers for Disease Control and Prevention (8319-2014)[6]với các điều kiện cơ bản như: nhiệt độ cột, nhiệt độ detector…

b) Xác định nồng độ MEK niệu trên 56 đối tượng nghiên cứu: bằng quy trình xây dựng được trên máy sắc kí khí khối phổ của Agilent.

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả xây dựng quy trình

3.1.1. Chuẩn hóa các điều kiện cho phép đo

    Đã tiến hành khảo sát, đánh giávàthu được kết quả của từng điều kiện như dưới đây.

a) Hóa chất và dung dịch chuẩn

Hóa chất: NaCl, Methanol, dung dịch MEK chuẩn với các nồng độ 0,01, 1; 2; 4; 6; 8; 10 mg/L

b) Các thông số cài đặt trên máy GC

    Tiến hành khảo sát đối với từng thông số và thu được các giá trị tối ưu. Tại các giá trị này kết quả của phép đo là tốt nhất. Giá trị của các thông số tối ưu cụ thể như sau:

►      Dectector MS:

- Tốc độ dòng He: 15mL/min

- Tốc độ dòng khí H2: 30mL/min

- Nhiệt độ inlet: 250oC

- Nhiệt độ detector: 250oC

- Chế độ chia dòng: 5:1

- Thể tích bơm mẫu: 4µl

- Chạy chế độ SIM, mảnh phô 43

►      Chương trình nhiệt

Các giai đoạn tăng nhiệt

Tốc độ tăng nhiệt oC/phút

Nhiệt độ oC

Thời gian giữ nhiệt
Thời gian chạy (phút)
Nhiệt độ đầu cột

4022
Giai đoạn tăng nhiệt 1 
1612018
Giai đoạn tăng nhiệt 1
25220012

3.1.2. Chọn các điều kiện lấy mẫu, xử lý mẫu để có dung dịch đo

a) Lấy mẫu

Mẫu nước tiểu được thu vào cuối ca của ngày làm việc cuối tuần. Thu từ 10 -15ml nước tiểu đựng vào ống thủy tinh có thể tích 20ml. Bảo quản lạnh tại hiện trường, khi đưa về phòng thí nghiêm được bảo quản ngăn mát tủ lạnh trước khi phân tích[6].

b) Xử lý mẫu

Mẫu được xử lý với nhiều điều kiện khác nhau và nhóm nghiêm cứu thu được điều kiện cho kết quả tốt nhất là quy trình xử lý mẫu như dưới đây:

     Bước 1: Hút chính xác 2ml nước tiểu vào vial có thể tích 20ml

     Bước 2: Thêm 1g NaCl

     Bước 3: Đóng nắp seta cố định miệng ống

     Bước 4: Phân tích trên máy GC

Dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn được xử lý như mẫu phân tích ở các mức nồng độ: 0,01; 1; 2; 4; 6; 8; 10 µg/mL

3.1.3. Đánh giá các điều kiện của quy trình

a) Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 

a1) Khảo sát khoảng tuyến tính

Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lượng đến giới hạn tuyến tính gọi là khoảng tuyến tính (dynamic range). Khoảng tuyến tính của mỗi nguyên tố phân tích ở mỗi vạch phổ khác nhau là khác nhau. Vạch phổ nào có độ hấp thụ càng nhạy thì khoảng tuyến tính càng hẹp[1], [2].

Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của MEK niệu bằng cách: pha một dãy chuẩn của MEK trong nước tiểu không phát hiện MEK là : 0,01; 0,1;1; 2; 3; 4; 5; 6; 8;10;12; 14; µg/mL.


Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy khoảng tuyến tính của MEK từ 0,01-10 µg/mL. Từ 11 µg/mL trở lên tín hiệu thu được giảm rõ rệt. Như vậy đề tài chọn khoảng tuyến tính cho phân tích MEK là 0,01-10 µg/mL cũng tương đối phù hợp với phương pháp tham khảo ở trên. Vì vậy khi phân tích mẫu nếu hàm lượng nguyên tố cần phân tích nằm ngoài khoảng tuyến thì phải làm giàu mẫu hoặc pha loãng mẫu để phân tích mới đảm bảo được độ chính xác của phép đo.

a2) Xây dựng đường chuẩn

* Đường chuẩn

Từ kết quả khảo sát khoảng tuyến tính nhóm nghiên cứu sử dụng phần mềm minitab 18.0 để xây dựng đường chuẩn. Phương trình đường chuẩn của MEK trong nước tiểu được chỉ ra ở dưới đây:


Để khẳng định phương pháp không bị mắc sai số hệ thống đề tàitiến hành kiểm tra hệ số a theo tiêu chuẩn thống kê Fisher (chuẩn F) [1], [2].

Nếu Ftính< Fchuẩn (F(0.95; 5; 4)) thì sự sai khác giữa giá trị a và 0 không có ý nghĩa thống kê và ngược lại. Kết quả đánh giá của đề tài cứu cho thấy Ftính = S’2/S2= 4,19; Fchuẩn = F(0,95;5;4) = 5,19, tức là Ftính< Fchuẩn ở phương trình đường chuẩn phân tích MEK trong nước tiểu. Có nghĩa là sự sai khác giữa giá trị a và 0 không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy đề tài xác định phương pháp phân tích trên không mắc sai số hệ thống.

b) Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Đối với sắc ký khí thì việc xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) dựa theo tỷ số tín hiệu/nhiễu đường nên là khá phổ biến[1], [2]. Nhóm nghiên cứu sử dụng cách này để tính LOD, LOQ bằng cách thêm một lượng chất chuẩn nhỏ dần vào mẫu nước tiểu không phát hiện MEK và tại nồng độ 0,003µg/mL thu được tín hiệu cao gấp 3 lần so với tín hiệu đường nền. Như vậy theo phương pháp tính LOD dựa trên tỷ số tín hiệu/nhiễu nhóm nghiên cứu thu được LOD=0,003µg/mL, LOQ=0,01µg/mL

Căn cứ vào kết quả thu được nhóm nghiên cứu nhận thấy trong quy trình phân tích MEK trong mẫu nước tiểu có giới hạn phát hiện 0,003µg/mL, giới hạn định lượng là 0,01µg/mL. Vậy khoảng tuyến tính của MEK trong quy trình phân tích MEK niệu là (LOQNước tiểu– 10)µg/mL tương đương (0,01-10)µg/mL.

c) Đánh giá độ chính xác của phương pháp/ quy trình trình kỹ thuật

Theo quan điểm của tiêu chuẩn quốc tế (ISO – 5725) và tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 6910) độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua độ chụm và độ đúng [1], [2].

-        Độ chụm chỉ mức độ giao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình. 

-        Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.

c1) Kiểm tra độ chụm


Trong đó

                        SD: Độ lệch chuẩn

                        n: Số lần lặp lại thí nghiệm

                        xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

                        x ̅ : Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm

                        CV%: là hệ số biến thiên của phép đo;

Độ chụm thay đổi theo nồng độ các chất phân tích. Nồng độ chất phân tích càng thấp thì kết quả dao động càng nhiều (không chụm) nghĩa là RSD% hay CV% lớn.

Có một số cách khác nhau để kiểm tra độ chụm, tuy nhiên trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi kiểm tra độ chụm bằng cách dùng mẫu thêm chuẩn - pha ba loại mẫu có nồng độ thêm chuẩn gần giá trị ở điểm đầu, điểm giữa, điểm gần cuối của khoảng tuyến tính (tương đương với các mức nồng độ thấp, trung bình, cao). Mỗi mức nồng độ lặp lại 10 lần. Trên cơ sở kết quả các mẫu lặp lại nhóm nghiên cứu đánh giá CV% kết quả thu được như sau: 


Kết quả khảo sát trình bày trong bảng 3.2 cho thấy CV% ở cả ba điểm (đầu, giữa, cuối) của khoảng tuyến tính đều nằm trong tiêu chuẩn cho phép.  Theo tiêu chuẩn đánh giá của AOAC nồng độ chất phân tích từ 0,1 mg/L CV% cho phép là < 11%, từ 1mg/L CV cho phép ≤ 7,3%. CV% của đề tài thu được từ 1,596 – 2,296%, điều đó chứng tỏ phương pháp đạt độ chụm.

c2) Đánh giá độ đúng của phương pháp:

Có nhiều cách để đánh giá độ đúng của phương pháp. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hiệu suất thu hồi, kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi được trình bày ở bảng 3.3 dưới đây: 


Theo tiêu chuẩn của AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists – Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức) về đánh giá độ thu hồi thì độ thu hồi của phương pháp phân tích MEK là đạt tiêu chuẩn. Nồng độ chất phân tích từ 0,1 - 10 µg/mL thì hiệu suất thu hồi (R%) cho phép là từ 80 – 110%, CV% cho phép < 7,3%[2]. Từ kết quả ở bảng trên cho thấy hiệu suất thu hồi đều nằm trong giới hạn cho phép, giá trị CV% lớn nhất đối điểm đầu khoảng tuyến tính là 2,296% (với MEK) các giá trị này đều nhỏ hơn 7,3%. Cụ thể hiệu suất thu hồi từ (97 - 103,1)%. Kết quả này cho thấy phương pháp đảm bảo độ đúng.

Từ kết quả kiểm tra độ chụm và độ đúng của phương pháp cho thấy các phương pháp phân tích MEK niệu niệu mà đề tài lựa chọn áp dụng đảm bảo độ chính xác. Dựa vào kết quả đánh giá đề tài thu được độ chính xác của phương pháp phân tích MEK niệu là: ≥ 97,7%.

d) Đánh giá độ ổn định của phương pháp

Độ ổn định của phương pháp là khả năng cung cấp các kết quả có độ chính xác chấp nhận được dưới những điều kiện có sự thay đổi về một số điều kiện thực hiện phương pháp như: giữa người A người B, giữa máy A với máy B, giữa điều kiện A với điều kiện B. Đánh giá độ ổn định của phương pháp có thể sử dụng mẫu thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ của khoảng tuyến tính (khoảng đầu, khoảng giữa, khoảng cuối), lặp lại 10 lần ở mỗi mức nồng độ, đánh giá các nhóm kết quả trong điều kiện khác nhau[1], [2].


Với điều kiện thay đổi về thời gian, độ ổn định của phương pháp vẫn đảm bảo. Kết quả đánh giá được thể hiện ở bảng 4. Qua 3 tuần khác nhau kết quả mẫu lặp lại ở 3 mức nồng độ của khoảng tuyến tính có CV% nằm trong tiêu chuẩn cho phép của AOAC, đồng thời không có sự khác biệt về kết quả củacác khoảng thời gian (3 tuần) đánh giá.

Như vậy, qua việc đánh giá những tiêu chí cần thiết cho một quy trình phân tích, nhóm nghiên cứu nhận thấy quy trình phân tích MEK trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ là đạt yêu cầu của một quy trình phân tích.

Sau khi đánh giá quy trình đề tài nhận thấy các quy trình phân tích có một số đặc điểm dưới đây:

Cụ thể so với phương pháp của 8319 của NIOSH[6] phân tích trên máy sắc ký khí khối phổ GC/MS có LODMEK = 0,6mg/Ll thì LOD của đề tài tốt hơn nhiều (0,004mg/L). Nghiên cứu của Michitsuji H. và cộng sự (1992) [7], nghiên cứu của tác giả Chou J. S. và cộng sự[9] phân tích trên máy GC/MS có LOD lần lượt là 0,0036 mg/L, 0,042 mg/L tương đương với giới hạn phát hiện của đề tài. LOQ của đề tài là 0,01 mg/L tốt hơn LOQ của phương pháp 8319, cũng như tốt hơn LOQ trong nghiên cứu của tác giả tác giả Chou, J. S. và cộng sự [9] là 0,02 mg/L.

Ngoài ra độ thu hồi của chúng tôi là (98 - 04,02)% cũng tốt hơn nhiều so với so độ thu hồi của Chou J.S., (hiệu suất thu hồi 102 ± 8,6%), Michitsuji H.,  (92,0-101,7%).

Khoảng tuyến tính của chúng tôi thu được từ 0,1 - 10 mg/L rộng hơn khoảng tuyến tính của Chou, J. S. và cộng sự từ 0,27 - 8mg/L[9].

Quy trình có độ chính  xác, độ thu hồi nằm trong giới hạn cho phép của AOAC và tốt hơn của phương pháp của NIOSH 8319 và tương đương với các quy trình nghiên cứu trước đó cùng trên thiết bị GC.

Quy trình này có thể ứng dựng trên các máy thế hệ tương đương hoặc thế hệ tiếp theo của hãng. Đối với những hãng khác chỉ cần là những máy có điều kiện và tính năng kỹ thuật tương tự (ứng dụng) nếu hiện đại hơn thì càng tốt đều có thể dùng được.

3.2. Kết quả xác định chất chuyển hóa

Để ứng dụng quy trình phân tích nồng độ của MEK trong nước tiểu, chúng tôi lấy 56 mẫu nước tiểu của công nhân tiếp xúc với MEK ở một phân xưởng đế tại một cơ sở sản xuất da giày, phân tích nồng độ MEK


* Tiêu chuẩn cho phép nồng độ MEK trong nước tiểu của Hiệp hội các nhà vệ sinh công nghiệp Mỹ (ACGIH) là ≤ 2 mg/L; ** Khoảng giá trị thu được không tính các trường hợp không phát hiện

Kết quả bảng 5 cho thấy: Trong 56 đối tượng tiếp xúc được lấy nước tiểu xét nghiệm nồng độ MEK thì có 4 đối tượng (7,14%) vượt tiêu chuẩn cho phép (>2mg/L). Từ kết quả này chúng tôi nhận thấythực tế hiện nay, người lao động đang làm việc tại một số cơ sở sản xuất da giày có mức độ thấm nhiếm MEK vượt tiêu chuẩn cho phép. Trong khi Việt Nam chưa có giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với chất này. Chính vì vậy để bảo vệ người lao động có tiếp xúc với MEK, chúng tôi cho rằng Bộ Y tế nên xem xét, cân nhắc để bổ sung chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với MEK.

Sau khi sử dụng quy trình xây dựng được để phân tích mẫu thực, nhóm nghiên cứu nhận thấy quy trình ổn định, đảm bảo kết quả chính xác. Chính vì vậy quy trình dự thảo ban đầu không cần thay đổi gì sau khi nhóm nghiên cứu áp dụng thực tế.

4.  KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

1) Đã thử nghiệm thiết lập được quy trình kỹ thuật định lượng nồng độ MEK trong nước tiểu đảm bảo tính ổn định, độ chính xácvới các tiêu chí như sau:

     -  Khoảng tuyến tính: (0,01 -10) µg/mL.

     -  Giới hạn phát hiện: 0,003 µg/mL

     -  Giới hạn định lượng: 0,01 µg/mL

     -  Quy trình đảm bảo tính ổn định, độ chính xác trên 97%.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) tương đương và thấp hơn một số tác giả khác đã nghiên cứu, tiết kiệm hóa chất, thời gian phân tích.

2) Áp dụng quy trình xây dựng được đã phân tích 56 mẫu nước tiểu của 56 đối tượng tiếp xúcvới MEK cho thấy 7,14% số mẫu nước tiểu vượt quá giới hạn cho phép nồng độ MEK (>2mg/L) của Hiệp hội các nhà vệ sinh công nghiệp Mỹ (ACGIH).

4.2. Kiến nghị

      Các phòng thí nghiệm y sinh học cần áp dụng quy trình kỹ thuật xác định MEK trong nước tiểu để giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với MEK.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]     Tạ Thị Thảo (2010), "Giáo trình môn học Thống kê trong hóa phân tích", Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia Hà Nôi.

[2]     Viện kiểm nghiện an toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia (2010), "Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật học", NXB Khoa học và Kỹ Thuật.

[3]     Niu S. (2010), "ILO list of occupational diseases and health care workers", Asian-Pacific Newsletter on occupational health and safety, 17 (2), pp.34-38.

[4]     American Conference of Governmental Industrial hygienists (2013), "Methyl Ethyl Ketone In: Documentation of the Threshold Limit Values and Biological Exposure Indices, 7th Ed.", ACGIH, Cincnnati, OH.

[5]     American Conference of Industrial Hygienists (2018), "Threshold Limit Value for Chemical Substances and Physical Agents and Biological Exposure Indices".

[6]     https://www.cdc.gov/niosh/docs/2003-154/pdfs/8319.pdf

[7]     Michitsuji H., Ohara A., Fukuda M. et al. (1992), "Determination of acetone, methanol, and methyl ethyl ketone in urine using head-space gas chromatography (HS. GC)", Sangyo igaku. Japanese journal of industrial health, 34 (3), pp.243-252.

[8]     https://www.cdc.gov/niosh/docs/2014-151/pdfs/methods/8318.pdf.

[9]     Chou J. S., Shih T. S., and Chen C. M. (1999), "Detection of methyl ethyl ketone in urine using headspace solid phase microextraction and gas chromatography", J Occup Environ Med, 41 (12), pp.1042-1047.


(Nguồn tin: Vnniosh.vn)