Hướng dẫn kỹ thuật vi sinh an toàn phòng thí nghiệm

1. An toàn trong xử lý mẫu

Để giảm thiểu tối đa nguy cơ phơi nhiễm đối với các tác nhân nguy hại, nhân viên thí nghiệm cần tuân thủ một số yêu cầu sau trong khi xử lý các mẫu thí nghiệm:

Các vật dụng đựng mẫu: Các vật dụng đựng mẫu nên làm bằng thủy tinh hoặc tốt nhất là chất dẻo. Chúng phải đủ bền và không rò rỉ khi được đậy nắp đúng cách. Không để vật liệu thí nghiệm rây ra ngoài vật đựng. Vật đựng phải được dán hoặc ghi nhãn sao cho dễ nhận diện và xác định. Tài liệu về lý lịch hoặc đặc tính mẫu không được dùng để gói ngoài vật đựng mà nên cất riêng, tốt nhất trong túi ni lông chịu nước.

Vận chuyển mẫu trong khu thí nghiệm: Để tránh rò rỉ hay đánh đổ mẫu, giá để mẫu thường được đặt thẳng đứng và khít với lòng trong của một hộp đựng mẫu thứ hai. Hộp đựng mẫu thứ hai (bao ngoài) này thường được làm bằng kim loại hoặc nhựa, có thể hấp tiệt trùng được và chịu được hóa chất sát khuẩn. Chúng cần được tiệt trùng thường xuyên.

Tiếp nhận mẫu: Đối với các phòng thí nghiệm phải tiếp nhận thường xuyên hoặc lượng lớn mẫu từ bên ngoài, cần có một phòng hoặc khu vực riêng cho việc này.

Mở gói đựng mẫu: Cá nhân tiếp nhận và mở gói đựng mẫu cần nhận thức được đầy đủ về các tác nhân có thể gây hại cho sức khỏe, phải được hướng dẫn về các cảnh báo an toàn sinh học và được tập huấn về cách xử lý các tình huống, nhất là khi gói chứa mẫu bị rò rỉ hay bị vỡ. Hộp chứa mẫu bên trong (thứ nhất) chỉ nên được mở bên trong các tủ BSC với sự chuẩn bị sẵn các dung dịch sát khuẩn.

2. Sử dụng pipet và dụng cụ hỗ trợ hút mẫu

Việc sử dụng pipet cần tuân thủ các yêu cầu sau:

1. Dùng dụng cụ hỗ trợ pipet trong mọi trường hợp sử dụng pipet hút. Nghiêm cấm hút pipet bằng miệng.
2. Mọi pipet hút phải có đầu hút được hút bằng bông để tránh “xộc” và rây bẩn chất lây nhiễm vào các dụng cụ hỗ trợ pipet.
3. Không được để cho khí thổi qua bề mặt dịch lỏng chứa tác nhân gây bệnh.
4. Không trộn các dịch chứa vật liệu lây nhiễm bằng cách dùng pipet hút và thổi luân phiên.
5. Thao tác nhẹ nhàng khi thổi dịch lỏng ra khỏi pipet (không được thổi mạnh).
6. Các pipet được đánh dấu tịnh tiến lùi được ưa dùng hơn so với các loại pipet khác, vì khi dùng chúng không cần phải đuổi giọt dịch lỏng cuối cùng ra khỏi pipet.
7. Các pipet đã nhiễm bẩn cần được sát khuẩn hộp đựng khó vỡ chứa sẵn dung dịch sát khuẩn. Chúng cần lưu ở đó trong thời gian đủ dài trước khi vứt bỏ.
8. Hộp đựng pipet vứt bỏ nên được để trong các tủ BSC, không để bên ngoài.
9. Không dùng các xilanh lọc có đầu kim tiêm để hút dung dịch thay pipet.
10. Đối với chai có nắp cao su, nên dùng dụng cụ mở nút, rồi dùng pipet để hút dịch thay cho việc dùng xilanh và kim tiêm.
11. Để tránh sự phát tán vật liệu lây nhiễm có thể rớt ra từ đầu pipet, cần có tấm lót có tính thấm đặt dưới bề mặt thao tác; phải loại bỏ nó như rác có thể lây nhiễm.

Dụng cụ hỗ trợ pipet hút cần được dùng thường xuyên trong các quy trình cần dùng đến pipet hút, nghiêm cấm hút pipet loại này bằng miệng.

Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng pipetman để hút mẫu. Khi sử dụng pipetman, nên bố trí tư thế thoải mái, thực hiện các thao tác dứt khoát, chính xác ở tốc độ đều đặn vừa phải, thỉnh thoảng cho ngón tay nghỉ, thỉnh thoảng đổi vị trí ngồi, thả lỏng vai và cánh tay.

Nguyên tắc dùng pipetman:

1. Chọn đúng loại pipetman trong vùng dung tích cần đo. Thể tích đo tối thiểu 10 – 20% thể tích tối đa của pipet, không đặt pipet quá thể tích tối đa.
2. Đặt pipetman đúng dung tích cần đo.
3. Thao tác gắn đầu tip pipet phải đúng: chọn đúng loại đầu tip pipet phù hợp. Ấn pipet vào đầu típ kết hợp xoay nhẹ; nếu không xoay có thể có khe hở giữa pipet và đầu típ dẫn đến thể tích hút thực sai và pipet nhỏ giọt.
4. Kiểm tra pipet phân phối đúng thể tích theo định kỳ (3-6 tháng/lần) bằng cách dùng nước cất và cân phân tích (10^-4 g) để kiểm tra 1mg = 1µl =1mm³ . Sai số không nên vượt quá 1% dung tích thực cần đo.
5. Hút dung dịch đúng cách bằng cách giữ pipet thẳng, đẩy nút pitong đến vị trí dừng thứ nhất, cho đầu pipet vào dung dịch, từ từ nhả nút pitong sao cho không có bọt khí, chờ thêm 1-2 giây để đảm bảo dịch đã được hút lên hoàn toàn.
6. Quan sát nhanh để kiểm tra lượng dung dịch có trong đầu típ, so sánh với các vạch chia đã có sẵn trong đầu típ, đầu típ không có hiện tượng nhỏ giọt là được.
7. Phân phối (nhả) dung dịch đúng quy cách: đặt đầu típ chạm nhẹ vào thành ống hứng, nghiêng một góc 10-15⁰ C, đẩy nút pitong từ từ tới vị trí dừng 1, chờ 1-2 giầy để đảm bảo dung dịch chảy ra, đẩy dứt khoát nút pitong tới vị trí dừng cuối để nhả toàn bộ dung dịch vào ống đựng, nhấc pipet cùng đầu típ khỏi ống hứng.
8. Nhả đầu típ bằng cách ấn vào nút nhả đầu típ, thay đầu típ cho lần thao tác tiếp theo
9. Pipet cần được duy tu, bảo dưỡng theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

3. Tránh phát tán vật liệu lây nhiễm

Để tránh phát tán các vật liệu lây nhiễm, cần thực hiện các yêu cầu sau:

1. Để hạn chế khả năng làm rơi vật liệu khi thao tác, các vòng ở đầu que cấy vi sinh vật phải là vòng tròn kín, đường kính khoảng 2 – 3 mm. Chiều dài cán cầm không quá 6cm để hạn chế độ rung.
2. Nguy cơ đánh rơi các giọt vật liệu lây nhiễm khi sử dụng các loại đèn cồn hoặc đèn gas để khử trùng que cấy trong các tủ BSC có thể tránh được nếu thay thế chúng bằng các lò nung mi ni chuyên dụng để khử trùng que cấy. Nếu có thể, tốt nhất nên sử dụng các que cấy  dùng một lần (vì không cần khử trùng lại).
3. Cần chú ý mẫu không có bọt nước để tránh tạo sol khí (bụi khí).
4. Các mẫu để vứt bỏ và các vi sinh vật cần tiệt trùng hoặc bỏ đi phải được để trong hộp hoặc túi kín (ví dụ: túi đựng rác phòng thí nghiệm). Phần nắp phải có ký hiệu an toàn (ví dụ như băng dính báo hiệu đã khử trùng) trước khi bỏ vào thùng rác chung.
5. Các khu vực làm việc phải được tiệt trùng bằng dung dịch sát khuẩn phù hợp vào cuối mỗi ngày làm việc.

4. Cách sử dụng tủ an toàn sinh học

Các đặc điểm cấu tạo và nguyên tắc vận hành cơ bản của các tủ ATSH đã được nêu ở modul 3. Dưới đây là các yêu cầu kỹ thuật khi sử dụng:

1. Cách sử dụng và các hạn chế của tủ ATSH cần được giải thích cho mọi người sử dụng. Các quy trình vận hành và sử dụng tủ an toàn đúng cách cần được viết thành tài liệu hướng dẫn và giới thiệu với mọi nhân viên phòng thí nghiệm. Đặc biệt cần nhận thức rõ rằng, việc sử dụng tủ chỉ hiệu quả khi tủ được vận hành đúng và tủ không bảo vệ được người làm việc khi làm đổ vỡ hoặc thao tác kém.
2. Không dùng tủ khi nó không hoạt động tốt.
3. Không mở kính chắn phía trước khi tủ đang được sử dụng.
4. Hạn chế tối đa lượng dụng cụ và vật liệu đưa vào trong tủ. Luồng không khí ở bộ phận thông khí phía sau không được bịt kín.
5. Không nên dùng đèn cồn hoặc đèn gas trong tủ. Sức nóng có thể làm đổi hướng dòng khí và có thể làm hỏng màng lọc. Có thể sử dụng lò nung tiệt trùng que cấy, nhưng tốt hơn là dùng các que cấy sử dụng một lần.
6. Mọi thao tác cần được tiến hành ở giữa hay phía sau bề mặt làm việc ở tầm có thể nhìn rõ qua tấm kính chắn phía trước.
7. Hạn chế đi qua phía sau người đang sử dụng tủ.
8. Người đang vận hành tủ không nên cử động cánh tay nhiều, vì có thể làm mất ổn định dòng khí trong tủ.
9. Không được để giấy ghi chép, giẻ lau hay vật dụng nào khác che lấp lưới khí ở phía trước tủ, vì như vậy có thể làm phá vỡ dòng khí và gây nhiễm khuẩn vật liệu và phơi nhiễm đối với người vận hành.
10. Bề mặt tủ cần được làm sạch bằng dung dịch tẩy trùng phù hợp sau khi hoàn thành công việc vào cuối mỗi ngày.
11. Quạt gió của tủ nên được bật ít nhất 5 phút trước khi bắt đầu công việc và sau khi công việc hoàn thành.
12. Không bao giờ để giấy tờ làm việc bên trong tủ.

5. Sử dụng máy ly tâm

1. Thực hiện chính xác các kỹ thuật theo nguyên tắc cơ học là điều kiện tiên quyết về an toàn sinh học trong sử dụng các máy ly tâm.
2. Máy ly tâm cần được vận hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
3. Máy ly tâm phải đặt ở độ cao phù hợp sao cho nhân viên có thể nhìn thấy lòng máy (bát đặt trục quay) để có thể lắp đặt đúng thùng đựng ống ly tâm và ống ly tâm.
4. Các ống ly tâm và ống đựng mẫu dùng để ly tâm nên làm bằng thủy tinh dày, hoặc tốt hơn là bằng chất dẻo và cần được kiểm tra phát hiện lỗi trước khi dùng.
5. Các ống ly tâm đựng mẫu nên được đậy nắp (nắp xoáy nếu cần) trong quá trình ly tâm.
6. Cầm kiểm tra cân bằng thùng đựng ống ly tâm; nên lắp và mở thùng đựng ống ly tâm trong tủ ATSH.
7. Cân ống ly tâm được cân bằng thành từng đôi và đặt chúng đối diện qua trục quay để đảm bảo thùng đựng ống ly tâm cân bằng đối xứng.
8. Nhà sản xuất cần hướng dẫn rõ khoảng cách cho phép từ mặt chất lỏng đến nắp (hay mép) ống ly tâm.
9. Nên dùng nước cất hoặc cồn (etanol 70%) để làm cân bằng ống không chứa mẫu. Không dùng các dung dịch nước muối hay hypoclorit vì chúng ăn mòn kim loại.
10.  Đối với các vi sinh vật nhóm nguy cơ 3 và 4, phải dùng thùng đựng ống ly tâm loại có nắp kín (cốc an toàn).
11.  Khi sử dụng rôto góc, không được đổ dịch chứa mẫu quá đầy vì nó có thể tràn ra ngoài do độ nghiêng.
12. Cần kiểm tra hàng ngày xem lòng máy ly tâm phần ngang rôto có bị vấy bẩn hay không. Nếu có vết bẩn bắn ra thì cần kiểm tra lại các quy trình ly tâm.
13. Cần kiểm tra hàng ngày để phát hiện có hay không dấu hiệu ăn mòn hay rạn nứt của rôto hay thùng đựng ốn ly tâm.
14. Giá đựng ống nghiệm và thùng đựng ống ly tâm cần được tẩy trùng sau mỗi lần sử dụng.
15. Sau khi sử dụng, nên úp thùng đựng ống ly tâm để làm khô.
16. Các hạt nhiễm khuẩn qua không khí có thể bắn ra ngoài khi ly tâm. Do tốc độ ly tâm, những hạt này bay với tốc độ lớn khiến dòng khí trong các tủ ATSH loại I hoặc II giữ lại được nếu như máy ly tâm có phần phía trước hở. Máy ly tâm kín đặt trong các tủ ATSH loại III có thể giúp ngăn sự phát tán của các sol khí. Tuy nhiên, chỉ những thao tác sử dụng máy ly tâm đúng với các ống ly tâm có nắp đậy an toàn mới giúp bảo vệ hữu hiệu sự hình thành các sol khí và sử phát tán của các hạt.

6. Sử dụng máy trộn, lắc, nghiền và thiết bị có sử dụng sóng siêu âm

1. Không nên dùng máy xay gia dụng trong các phòng thí nghiệm, vì chúng có thể bị rò rỉ và tạo ra các sol khí. Các máy trộn, lắc và nghiền đồng thể được thiết kế cho phòng thí nghiệm có tính an toàn cao hơn.
2. Nắp đậy, cốc hoặc chai đựng mẫu không được rạn nứt hay biến dạng. Nút đậy cần khít và các vòng đệm cần ở trạng thái tốt.
3. Các máy nghiền đồng thể, máy lắc và máy siêu âm có thể tạo ra áp suất trong các ống nghiệm khi hoạt động. Các sol khí mang theo tác nhân gây nhiễm có thể thoát qua khe của nắp đậy và ống. Nên sử dụng ống đựng bằng chất dẻo hoặc tốt nhất là PTFE (polytetrafluoroethylene) vì các ống thủy tinh có thể bị vỡ, làm bắn ra các vật liệu gây nhiễm hoặc gây thương tích cho người vận hành.
4. Khi sử dụng, các máy nghiền đồng thể, máy lắc, máy siêu âm nên được phủ ngoài bằng một màng chất dẻo trong suốt. Màng này được tẩy trùng sau khi sử dụng. Nếu có thể, những máy này nên được sử dụng trong các tủ ATSH.
5. Sau khi xử lý mẫu bằng các máy này, hộp đựng mẫu được mở trong tủ ATSH.
6. Nên đeo bịt tai bảo hộ khi dùng máy siêu âm và máy nghiền đồng thể.

7. Bảo trì và sử dụng tủ lạnh, tủ lạnh sâu

1. Nên rã đông và làm vệ sinh định kỳ các loại tủ lạnh, tủ lạnh sâu và hộc chứa đó khô (đá cacbon dioxit); đồng thời vứt bỏ các hộp chứa mẫu, ống nghiệm … bị vỡ sau thời gian bảo quản. Khi làm vệ sinh, phải đeo dụng cụ bảo vệ mặt và găng cao su dày. Sau khi lau sạch, bề mặt trong tủ cần được tẩy trùng.
2. Tất cả các hộp (hoặc túi) đựng mẫu trong tủ lạnh đều cần được dán nhãn và ghi rõ tên khoa học của vật liệu chứa bên trong, thời gian bắt đầu bảo quản và tên người cất mẫu. Các vật liệu mất nhãn và quá hạn phải được hấp tiệt trùng và loại thải.
3. Phải có một bản kiểm kê các đồ được lưu trữ trong tủ lạnh.
4. Các dung dịch dễ cháy không được giữ trong tủ lạnh trừ khi được chứa trong các hộp chống nổ. Nếu có những vật liệu đặc biệt như vậy, cần dán nhãn trước cửa tủ.

8. Một số lưu ý khi làm việc với vi sinh vật

1. Với E. Coli và Phage: luôn thao tác trong tủ ATSH cấp 1. Cần phải tiến hành khử trùng các vật liệu thí nghiệm, rác thải …sau khi làm việc. Nên thanh lý và loại bỏ các chủng vi sinh vật trong PTN hai lần mỗi năm và thay thế theo định kỳ bằng cách cấy các chủng vi sinh vật đó từ một nguồn stock sạch.
2. Với các chủng nấm men biến đổi gen không gây bệnh: Thao tác trong tủ ATSH cấp 1 và phòng dành riêng để tránh các lây nhiễm chéo.
3. Với các chủng virus biến đổi gen và các vector có nguồn gốc virus: Cần tiến hành trong PTN cấp 2 và tủ ATSH cấp 2, ra vào PTN phải có quy định. Làm việc với một loại vector có nguồn gốc virus, virus riêng. Sau khi kết thúc với một loại, cần tiến hành khử nhiễm đối với tủ ATSH và bề mặt làm việc trước khi tiến hành thí nghiệm mới, liên quan đến chủng loại virus khác. Trường hợp làm việc với các đoạn chèn vào vector liên quan đến gen mã hóa protein liên quan đến phản ứng miễn dịch, cần tiến hành trong PTN và tủ ATSH cấp 3.
4. Với các chủng Agrobacterium biến đổi gen: Hầu hết các nhà nghiên cứu đều tiến hành với các chủng A. Tumefaciens đã được làm mất khả năng gây hại và không gây ung thư, được xếp vào cấp độ 1. Làm việc với các chủng dại hoặc A. rhizogenes kết hợp với các vector chuyển gen thực vật cần tiến hành trong PTN cấp 2 và tủ ATSH cấp 2. Tất cả các rác thải nghiên cứu cần phải được khử nhiễm bằng cách khử trùng. Khi cấy chuyển các cây con đã chuyển gen sang môi trường nuôi cấy mới thường tiến hành đối với các tủ ATSH cấp 1, vì vậy cần kiểm tra để không đồng thời mở nguồn Agrobacterium nào cùng lúc.
5. Khi làm việc trong các buồng nuôi cấy: nên đóng cửa buồng nuôi và không nên thiết kế của mở đưa không khí trong buồng ra bên ngoài. Các cây con thải loại phải được khử nhiễm trước khi đưa ra bên ngoài như rác thải bình thường (khi vật liệu chứa A. Tumefaciens). Cần tránh sự phát tán hạt và các bộ phận sinh sản của thực vật phải được bất hoạt trước khi đưa ra bên ngoài như rác thải bình thường.
6. Khi làm việc trong nhà kính, nhà lưới: khi làm việc với loài cây thụ phấn nhờ côn trùng, tất cả các lối phải có lưới chắn côn trùng. Không nên thiết kế cửa mở đưa không khí bên trong ra bên ngoài, và phải có nút không khí. Đối với các loài cây không có hoa, tự thụ phấn, sinh sản vô tính hoặc thụ phấn nhờ gió thì không cần lưới chắn côn trùng và nút không khí. Cần tránh sự phát tán hạt. Thu hạt cẩn thận. Đất dùng để trồng cây phải được khử trùng trước khi tái sử dụng hoặc thải ra bên ngoài. Các bộ phận sinh sản của thực vật phải được bất hoạt trước khi đưa ra bên ngoài như rác thải bình thường.

(Nguồn tin: Theo tài liệu tập huấn an toàn sinh học – Bộ khoa học và công nghệ)