Nghiên cứu rủi ro người lao động tiếp xúc nấm mốc sinh độc tố trong không khí môi trường lao động tại cơ sở chế biến gạo
MỞ ĐẦU
Hiện tỷ lệ các bệnh do yếu tố sinh học gây ra đã được phát hiện rất nhiều như nấm phổi, ngộ độc, ung thư do độc tố của nấm mốc. Nghiên cứu tiếp xúc nghề nghiệp với các yếu tố sinh học hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều, chưa tạo ra một hướng nghiên cứu chuyên sâu. Nghiên cứu phát hiện nguy cơ ngộ độc thực phẩm do độc tố có trong các sản phẩm gạo, lạc và ngô đã phát hiện rất nhiều trên thế giới. Tác giả Đẵng Vũ Hồng Miên đã nghiên cứu xác định được một số nấm sinh độc tố trong ngành thực phẩm và trong ngành khí tài quân sự, kết quả cho thấy nguyên nhân do điều kiện môi trường địa lý tại Việt Nam rất phù hợp với sự sinh trưởng phát triển của vi nấm như Aspergillus spp, Penicillium spp. Talaromyces spp. Tuy nhiên việc nghiên cứu tiếp xúc nghề nghiệp nấm mốc có nguy cơ sinh độc tố, gây bệnh thì hiện nay chưa có nhiều. Nghiên cứu phát hiện nấm mốc có nguy cơ sinh độc tố có trong không khí môi trường lao động là rất cần thiết, góp phần bảo vệ sức khỏe người lao động, tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất. Nghiên cứu định danh chủng nấm mốc Aspergillus spp sinh độc tố có mặt trong không khí chưa được nghiên cứu. Việc lấy mẫu và định danh nấm mốc mới được đề cập quan tâm gần đây, do khi tiếp xúc nấm mốc trong không khí không gây bệnh hay ngộ độc cấp tính. Maja Šegvić Klarić và cộng sự đã nghiên cứu về tiếp xúc nghề nghiệp của công nhân với nấm mốc trong không khí xưởng cưa tại Croatia và đã phát hiện ra nhiều công nhân bị viêm mũi dị ứng, viêm phổi mãn tính nguyên nhân do nấm mốc gây ra. Ngoài ra, các nghiên cứu tiếp xúc của công nhân sản xuất sữa gạo đã phát hiện nấm A. falvus sinh độc tố Aflatoxin(Maja Šegvić Klarić). Do đó nguy cơ người lao động tiếp xúc chủ yếu mang tính thụ động với những thành phần nấm mốc trong không khí là rất cao, đa phần người lao động không thể biết được mức độ nguy cơ tiềm ẩn trong đó. Người lao động tiếp xúc Aspergillus spp có nguy cơ bị ngộ độc hoặc mắc các bệnh như bệnh Aspergillosis. Các độc tố có thể tích lũy trong cơ thể gây ra bệnh ung thư rất cao.
Thông tin từ Tạp chí Khoa học & Ứng dụng số 12-2010 đã đưa ra những cảnh báo về nguy cơ của nấm Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin rất nguy hiểm, khả năng gây ung thư rất cao. Thử độc tính của các Aflatoxin bằng liều LD50 với vịt con một ngày tuổi kết quả cho thấy Aflatoxin B1. Một số nghiên cứu xác định nấm A. flavus trên một sô nông sản như ngô đã cho thấy những chủng nấm A. flavus sinh độc tố ảnh hưởng lớn đến chất lượng của thực phẩm.
Hiện nay đối với những nấm mốc sinh độc tố được phát hiện nhiều trong thực phẩm và một số dược liệu, thuốc nam đều phát hiện có các chủng Aspergillus spp sinh độc tố mycotoxin. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện những chủng nấm Aspergillus spp có nguy cơ sinh độc tố như nấm Aspergillus flavus hay Aspergillus paraticus sinh độc tố Aflatoxin B1, B2, G1, G2. Độc tố Aflatoxin B1 là nguy hiểm nhất Susana Viegas et al. (C eline M. O’GORMAN, 2011). Trong nhưng năm gần đây theo khuyến cáo của Bộ Y tế về tính độc của Aflatoxin B1 trong thực phẩm có tính bền ở nhiệt độ cao không bị phân hủy, khi đi vào cơ thể được lũy ở các mô gan và một số mô tế bào khác. Đối với nấm Talaromyces spp chúng có khả nămg sinh ra các độc tố như Rubratoxin, luteoskyrin, spiculisporic acid và rugulovasins, những loại độc tố được cho là gây tổn thương đến ga, thận, mật. Nếu tiếp xúc với lượng nhiều có nguy cơ gây ngộ độc cấp tính với các triệu chứng như xuất huyết, hủy hoại gan thay đổi đường tiêu hóa, hấp thu các sản phẩm trao đổi chất và chết. Ngộ độc mãn tính với những biểu hiện bệnh như chuyển hóa thức ăn yếu, tỉ lệ tăng trưởng thấp (Samson và cộng sự; 2012). Chính sự tích lũy này là nguyên nhân gây ra ung thư ở người. Nghiên cứu đánh giá nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe người lao động tiếp xúc với nấm mốc sinh độc tố trong không khí giúp phòng tránh nguy cơ người lao động tiếp xúc phải những nấm mốc này. Việc xác định nguy cơ cần định danh, mô tả được chính xác chủng nấm mốc có sinh độc tố là rất quan trọng để xác định cấp nguy cơ gây ra cho người lao động.
I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng nghiên cứu
Nấm mốc sinh độc tố trong không khí môi trường lao động tại các cơ sở chế biến nông sản tại thị trấn Trôi, Hoài Đức, Hà Nội.
2. Môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường CAM (g/l): Coconut cream 100 g; thạch 20; nước cất 1.000 ml; pH 6,8 ÷ 7,0, khử trùng 121oC, 15 phút.
Thành phần môi trường ADM (g/l): Peptone10;Yeast extract20 ;Ferric ammonium citrate 0,50; Dichloran 0,002; thạch 20; nước cất 1000 ml; pH 6,8 ÷ 7,0, khử trùng 121oC, 15 phút
Thành phần môi trường Sabouraud (g/l): Pepton 10; glucoza 20; thạch 20; nước cất 1.000 ml; pH 5,4 ÷ 5,8 khử trùng 121oC, 15 phút.
Môi trường Czapek (g/l): NaNO3: 3,5; K2HPO4: 1,5; MgSO4:0,5; KCl: 0,5; FeSO4:0,1; glucoza: 80 g; thạch 20;pH 4,5 ÷ 5,5 khử trùng 121oC, 15 phút.
3. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp lấy mẫu chủ động bằng thiết bị SpinAir tốc độ lấy mẫu là 100 lít/phút. Cách tính tổng nấm mốc trong 1 m3 không khí của phương pháp chủ động [8].
Trong đó: X: Tổng số vi sinh vật trong 1m3 không khí (CFU/m3)
A: Tổng số vi sinh vật đếm được trong đĩa thạch
1000: 1 m3 không khí được quy đổi tương đương với 1.000 lít không khí.
V: thể tích lấy mẫu
Xác định đặc điểm hình thái đại thể và vi thể nấm mốc có khả năng sinh độc tố theo các tài liệu của Việt Nam có Đặng Vũ Hồng Miên và cộng sự cuốn Hệ Nấm Mốc Việt Nam.Một số khóa phân loại của Van et al và Colour Atlas of diagnostic microbiology. Hình thái bào tử và sợi nấm được chụp tại Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh Bảo vệ lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh. Định danh các chủng bằng phương pháp sinh học phân tử với cặp mồi ITS1-5,8S – ITS4 trên máy giải trình tự ABI. Xác định nấm mốc sinh độc tố bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc là CAM sau đó chiếu đèn UV 365 nm vào, nấm mốc sinh độc tố sẽ phát huỳnh quang. Qua màu sắc phát quang xác định được chủngnấm mốc sinh ra độc tố. Phương pháp xử lý số liệu Mega 7.0 và SAS studio.
II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Lấy mẫu nấm mốc sinh độc tố trong không khí
Thiết bị lấy mẫu nấm mốc không khí SpinAir với tốc độ lấy mẫu 100 lít/phút không khí được đi thẳng vào bề mặt thạch đặt bên trong thiết bị. Thời gian lấy mẫu từ 1 ÷2 phút. Kết quả nấm mốc phát hiện trên môi trường ADM, CAM chọn lọc nấm mốc sinh Aflatoxin và độc tố. Nghiên cứu này tập trung vào việc tìm ra những chủng nấm mốc có khả năng sinh độc tố ảnh hưởng đến sức khỏe người lao động có tiếp xúc.
Trong Hình 1 thấy hai khuẩn lạc nghi ngờ là những chủng nấm mốc Aspergillusspp được ký hiệu T4.1 và Talaromyces spp được ký hiệu VA.11. Chủng nấm biến đổi sắc tố môi trường qua một số đặc điểm có nguy cơ là những chủng sinh độc tố, dựa vào mô tả của những nghiên cứu đi trước của Đặng Vũ Hồng Miên về hệ nấm mốc ở Việt Nam và giáo sư Nguyễn Văn Đồng, khuẩn lạc này được phân lập thuần nhất và mô tả đặc điểm của chúng. Nghiên cứu này thực hiện mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái bào tử của nấm mốc đó và xác định liệu chúng có nguy cơ sinh độc tố. Kết quả xác định được số lượng bào tử nấm mốc có nguy cơ sinh độc tố trong không khí khu vực làm việc tại cơ sở chế biến gạo. Kết quả nấm mốc được xác định trên môi trường chọn lọc đối với những nấm mốc có nguy cơ sinh độc tố, với tổng số mẫu 30 mẫu tại 3 vị trí nạp liệu, gần máy xay xát, máy chuỗi bóng.
Bảng 1: Kết quả nấm mốc được xác định trên môi trường chọn lọc đối với những nấm mốc sinh độc tố.
1.1. Mẫu T4.1.
Mẫu T4.1 được phân lập thuần nhất từng chủng ra riêng biệt và quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và đặc điểm bào tử trên những môi trường khác nhau.
Bảng 2: Đặc điểm nhận dạng nấm Aspergillus sp. T4.1 trên môi trường khác nhau
1.1.1. Đặc điểm vi thể của chủng nấm Aspergillus sp
Quan sát vi thể là quan sát các bào tử của chủng nấm Aspergillus sp.T4.1 và Aspergillus sp.T1. Hình 2 được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) JSM-5410LV tại Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh.
Hình 2 cho thấy đầu mọc từ cơ chất, hình cầu, hình tỏa tia, hoặc hình xé rách kích thước 75÷275µm, cuống không màu xù xì có kích thước 150÷1125 x 15÷19µm, bọng hình gần cầu đến chùy có kích thước 21÷45 x 27 ÷64µm, có 2 loại thể bình lớp 1 và lớp 2, bào tử hình cầu có gai rõ kích thước 4÷5µm. Đặc điểm hình thái gần trùng hợp với sự mô tả trong cuốn sách Hệ Nấm mốc Việt Nam của Đặng Vũ Hồng Miên và Colour atlas of diagnotic microbiology có thể là chủng Aspergillus flavus.
1.1.2. Xác định trình tự chủng Aspergillus sp. T4.1
Đối với nấm mốc sử dụng trình tự đoạn gen 5,8S và 28S rARN là phổ biến hiện nay với đoạn m ITS1 và ITS4. Gen này có mặt trong tất cả các tế bào, chứa vùng bảo thủ cao và vùng biến đổi cho phép phân biệt giữa các loài khác nhau trong giới nấm mốc rất dễ dàng. Trình tự gen của chủng Aspergillussp.T4.1 được thể hiện ở Hình 3.
Kết quả phân tích gen ở trên cho thấy chủng Aspergillus sp T4.1 thể hiện mức độ tương đồng cao về trình tự nucleotit của đoạn gen với chủng A.flavus PHY190 và A.flavus FCBP1522 là 100%. Như vậy có thể khẳng định chủng Aspergillus sp T4.1 thuộc chủng A.flavus, được ký hiệu A.flavus T4.1.
1.2. Mẫu VA-11
Chủng nấm mốc Talaromyces spp là loại nấm chưa được nghiên cứu nhiều trên thế giới. Nhóm nghiên cứu của giáo sư Samson R.A và các cộng sự mô tả chi tiết, cả về đặc điểm hình thái và trình tự gen, xác định những hoạt chất sinh học do nấm này gây ra. Trong khuôn khổ bài báo này chủng Talaromyces spp được giải trình tự gen trên đoạn ITS 1 và ITS4 là đoạn gen được sử dụng phổ biến hiện nay trong nghiên cứu, và định danh nấm mốc. Kết quả giải trình tự gen được so sánh (blast) trên ngân hàng gen của NCBI.
Hình 4: Trình tự nucleotit của chủng Talaromyces spp VA.11
Kết quả giải trình tự gen và so sánh trên ngân hàng gen cho thấy VA-11 có mức độ tương đồng 100% so với chủng nấm Talaromyces purpureogenus.
2. Xác định nấm mốc sinh độc tố
Cấy mẫu chủng nấm mốc A. Flavus T4.1 và T. purpureogenus VA-11 lên trên môi trường CAM, nuôi cấy trong điều kiện 28o± 0,5oC thời gian 7 ngày, chiếu đèn UV 365 nm vào khuẩn lạc quan sát khả năng phát huỳnh quang của chủng nấm mốc.
Đây là hai trong những chủng mang gen có thể sinh ra độc tố, chúng tồn tại trong không khí gây rủi ro cho người lao động tiếp xúc với môi trường có chứa nấm mốc này. Theo WHO giới hạn cho phép nấm mốc trong không khí ở các khu vực trong nhà là 500CFU/m3và không chấp nhận mức trên 50CFU/m3 đối với chủng loại có nguy cơ gây bệnh và nguy hiểm cho người. Còn đối với một số các tổ chức khác như EU tiêu chuẩn tiếp xúc được cho là sạch, có nguy cơ thấp nhất là dưới 50CFU/m3 không khí.
Theo khuyến cáo của tổ chức WHO thì độc tố aflatoxin được xếp vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người, tổn thương đến gan, thận, mật. Ngộ độc cấp tính với các triệu chứng gồm sự xuất huyết, hủy hoại gan thay đổi đường tiêu hóa, hấp thu các sản phẩm trao đổi chất và chết. Ngộ độc mãn tính với những biểu hiện bệnh như sự chuyển hóa thức ăn yếu, tỉ lệ tăng trưởng thấp… Bên cạnh đó aflatoxin cũng làm giảm khả năng tiết sữa, đẻ trứng và sức đề kháng ở gia súc, gia cầm. Đối với bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Theo cảnh báo WHO các độc tố do Talaromyces purpureogenus sinh ra như rubratoxin, luteoskyrin, spiculisporic acid và rugulovasins gây nguy hại rất lớn đến sức khỏe con người (A.J. Chen, Samson và cộng sự; 2016). Chúng phá hủy các cơ quan trong cơ thể như thận, gan, viêm phổi, hen xuyễn, viêm dạ dày. Ngoài ra rubratoxin gây ra thiếu máu và xuất huyết ở gà; tạo màng bọc ống tiêu hóa do tế bào niêm mạc bị chết làm giảm hấp thu dưỡng chất có thể gây tử vong số lượng lớn gia cầm con và heo con. Dựa trên những giới hạn cho phép những chủng sinh độc tố gây bệnh cho người, cho thấy rủi ro khi tiếp xúc với nhưng chúng nấm như vậy. Do đó cần phải nghiên cứu xác định mật độ và phân lập xác định
Trong nghiên cứu này mới dừng ở việc xác định được chủng nấm có nguy cơ sinh độc tố và gây bệnh cho con người. Để từ đó đưa ra những biện pháp phòng tránh, giảm nguy cơ gây bệnh nghề nghiệp, xác định cơ chế sinh độc tố và cơ chế gây bệnh ở người cần có những nghiên cứu chuyên sâu hơn: xác định được gen sinh độc tố và gen sinh các hoạt chất sinh học có khả năng xâm nhập vào cơ thể gây bệnh.
III. KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã xác định và phân lập được hai chủng nấm mốc có đặc điểm khuẩn lạc đặc trưng của chủng nấm Aspergillus sp và Talaromyces sp ký hiệu là Aspergillus sp T4.1 và Talaromyces sp VA.11 trong không khí môi trường lao động tại cơ sở chế biến gạo, thị trấn Trôi, Hoài Đức, Hà Nội. Dựa vào nghiên cứu đặc điểm sinh học đại thể và vi thể và định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử cho độ chính xác cao trong việc định danh loài vi sinh vật hiện nay. Kết quả nghiên cứu này đã giải được trình tự gen của hai chủng nấm mốc trên với trình tự nucleotid ITS1 5,8S ITS4 so sánh trên Genbank chủng Aspergillus spT4.1 cho độ tương đồng 100% với chủng Aspergillus flavus PHY190 được ký hiệu là A.flavusT4.1 có khả năng sinh độc tố Aflatoxin là một trong những loại độc tố đã được khuyến cáo rất nhiều hiện nay trong thực phẩm, nằm trong nhóm chiếm đến 90% nguy cơ gây ra bệnh viêm xoang, bệnh nấm phổi (khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới). Chủng VA.11 có độ tương đồng 100% với chủng Talaromycespurpureogenus, có nguy cơ sản sinh ra các các độc tố rubratoxin và hoạt chất luteoskyrin, spiculisporic acid và rugulovasins gây hại cho người lao động.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đặng Vũ Hồng Miên, 2015:Hệ nấm mốc ở Việt Nam, NXB KH&KT Hà Nội.
2. Lê Thanh Long, Nguyễn Hiền Trang, 2014: “Nghiên cứu khả năng nấm mốc Aspergillus flavus trên ngô của một số hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên”. Tạp chí khoa học, Đại học Huế, T.94, S.6
3. Nguyễn Đinh Nga, 2012:Khảo sát mức độ nhiễm nấm mốc và alflatoxin trong một số dược liệu bán ở quận 5 – thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu Y học – Y học TP Hồ Chí Minh, 16 (1): 93-96.
4. Vũ Duy Thanh.2015:“Nghiên cứu xây dựng quy trình quan trắc tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm trong không khí môi trường lao động”. Tạp chí hoạt động khoa học công nghệ An toàn – Sức Khỏe và Môi trường Lao động, số 3,4,5 -2015, trang 26-32. ISN 1859-0896
5. A.J. Chen, B.D. Sun, J. Houdraken, J.C. Frisvad, N. Yilmaz, Y.G. Zhou, R.A. Samson, 2016. “New Talaromyces species from indoor environments in China”. Studies in Mycology 84, 119 -144.
6. N. Yilmaz, C.M. Visagie, J Houbraken, J.C. Frisvad, R.A. Samson. 2014. “Polyphasic taxonomy of the genus Talaromyces”. Studies in Mycology 78, 175 -341.
7. Yilmaz, N.; Houbraken, J.; Hoekstra, E.S.; Frisvad, J.C.; Visagie, C.M.; Samson, R.A..Delimitation and characterisation of Talaromyces purpurogenus and related species. Persoonia, Vol. 29, 2012, p. 39-54
8. C eline M. O’GORMAN, 2011:“Airborne Aspergillus fumigatus conidia: a risk factor for aspergillosis”. Fungal biology reviews 25, pp 151 – 157
9. Manisha Rajib Desai, Sandip Kumar Ghosh, 2003:“Occupational exposure to airborne fungi amongrice mill workers with special reference toaflatoxin producing A. flavus strains”. Ann Agric Environ Med, 10, 159-162.
10. Maja Šegvić Klarić, Veda Marija Varnai, Anita Ljubičić Čalušić, Jelena Macan. (2012). “Occupational exposure to airborne fungi intwo Croatian sawmills and atopy in exposed workers”. Annals of Agricultural and Environmental Medicine, Vol 19, No 2, 213-219.
11. Lúi M.de la Maza, Marie T. Pezzlo, Ellen Jo Baron: Colour Atlas of diagnotic Microbiology. Mosby-Year Book,Inc, 223 pp
12. Susana Viegas, Luisa Veiga, Paula Figueiredo, Ana Almeida, Elisabete Carolino1 and Carla Viegas. (2015) “Assessment of Workers’ Exposure to Aflatoxin B1 in a Portuguese Waste Industry”. Ann. Occup. Hyg., Vol. 59, No.2, 173–181.
13. WHO, 2009: Who guidelines for indoor air quality: Dampness and mould, ISBN 978 92 890 4168 3.
Vũ Duy Thanh1,a, Lê Anh Thư1 Nguyễn Thế Trang2 Nghiêm Ngọc Minh3
1Viện Khoa học An toàn và vệ sinh lao động, Tổng Liên đoàn lao động Việt Nam
2Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
3Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
aHọc viện khoa học và công nghệ- VAST
(Nguồn tin: Vnniosh.vn)
