Xây dựng kỹ thuật định lượng Aceton trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí

Tóm tắt:

Aceton niệu là chất được sử dụng làm chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với aceton. Việt Nam chưa có chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với chất này, cũng như chưa có quy trình phân tích chỉ số giám sát sinh học. Nhằm mục tiệu xây dựng được kỹ thuật định lượng aceton trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí GC/FID, với phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đã xây dựng quy trình phân tích aceton trong nước tiểu, đánh giá quy trình và đạt được các tiêu chí như: Khoảng tuyến tính ở khoảng nồng độ 0,025 -75 mg/L. Giới hạn phát hiện 0,025 mg/L. Giới hạn định lượng 0,1 mg/L. Quy trình đảm bảo tính ổn định, độ chính xác trên 94%. Hiệu suất thu hồi chúng tôi thu được đạt từ 94% – 101,6%. Quy trình này có thể áp dụng trong các phòng xét nghiệm có chức năng phân tích chất giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Aceton là một dung môi được sử dụng rất phổ biến trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là ngành công nghiệp như điện tử, bao bì, in, da giày, sản xuất sơn, các ngành công nghiệp có sử dụng sơn… Năm 2010, Tổ chức lao động Quốc tế ILO [1] đã công bố danh sách cách chất và nhóm chất gây bệnh nghề nghiệp được bảo hiểm, trong đó có aceton là chất thuộc nhóm keton. Theo kết quả khảo sát ban đầu tại một số cơ sở sản xuất cho thấy aceton xuất hiện khá phổ biến, thậm chí vượt tiêu chuẩn cho phép nhiều lần. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Kim Nhung [2], nồng aceton tại một số cơ sở in có một số vị trí đo được cao hơn tiêu chuẩn cho phép (1480 mg/m3 – tiêu chuẩn cho phép của Việt Nam là ≥ 200 mg/m3). Mặc dù người lao động trong các ngành công nghiệp được phát hiện có sử dụng aceton tương đối nhiều nhưng tại Việt Nam chưa có có giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với aceton cũng như chưa có quy trình phân tích cho chỉ số giám sát sinh học của chất này. Theo ACGIH thì aceton trong nước tiểu được sử dụng làm chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với aceton. Xuất phát từ thực tế đó nhóm nghiên cứu đã tiến hành “Xây dựng kỹ thuật định lượng aceton trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí GC/FID”.

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu là: xây dựng được quy trình phân tích aceton trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa với độ chính xác từ 94% trở lên, giới hạn định lượng 0,1mg/L và đề xuất ứng dụng vào việc nghiên cứu tiêu chuẩn giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với acetone.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Quy trình phân tích Aceton trong nước tiểu của người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp.

2.2. Phương pháp nghiên cứu 

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

Thử nghiệm xây dựng quy trình trong phòng thí nghiệm

2.2.2. Phương pháp kỹ thuật nghiên cứu

Xây dựng quy trình dựa theo tài liệu của Laboratory Procedure Manual – The Centers for Disease Control and Prevention (8319-2014) [3] kết hợp với phương pháp của Bianca [4] có biến đổi cho phù hợp với điều kiện phân tích của phòng thí nghiệm.

– Khảo sát, thử nghiệm và xây dựng quy trình kỹ thuật xét nghiệm trong phòng thí nghiệm của Trung tâm Sức khỏe nghề nghiệp – Viện Khoa học An toàn và Vệ sinh lao động Việt Nam.

Thử nghiệm ứng dụng phương pháp phân tích với các điều kiện:

– Thiết bị: Máy phân tích sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa và kĩ thuật tiêm mẫu Headspace (HS-GC-FID) (G3440A-GC7890A của Agilent), tủ âm 80⁰C…

– Dụng cụ: Các dụng cụ chuyên dùng như bình định mức, pipet, vial đựng mẫu 20ml, Cột DB-624 (Agilent-Mỹ).

– Hóa chất: Aceton; Methanol; NaCl của hãng Sigma đảm bảo độ tinh khiết để phân tích lượng vết.

– Mẫu nước tiểu của người không tiếp xúc với dung môi hữu cơ (được sử dụng làm nên mẫu trong quá trình khảo sát)

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả xây dựng quy trình

3.1.1. Chuẩn hóa các điều kiện cho phép đo

    Nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát, đánh giá và thu được kết quả của từng điều kiện như dưới đây:

* Thông số phân tích trên hệ thống bơm mẫu Headspace: Xem Bảng 1

Bảng 1: Thông số phân tích trên hệ thống bơm mẫu Headspace

* Thông số phân tích trên hệ thống GC-FID:

– Tốc độ dòng He: 28mL/min

– Tốc độ dòng khí H2: 40mL/min

–        Nhiệt độ inlet: 250oC

–        Nhiệt độ detector: 250oC

–        Chế độ chia dòng: 5:1

–        Thể tích bơm mẫu: 4µl

 Chương trình nhiệt độ cột:  Xem Bảng 2

Bảng 2: Chương trình nhiệt độ cột

3.1.2. Chọn các điều kiện lấy mẫu, xử lý mẫu để có dung dịch đo

Xử lý mẫu

Mẫu được xử lý với nhiều điều kiện khác nhau và nhóm nghiên cứu thu được điều kiện cho kết quả tốt nhất là quy trình xử lý mẫu như dưới đây:

Bước 1: Hút chính xác 2ml nước tiểu vào vial có thể tích 20ml

Bước 2: Thêm 1g NaCl

Bước 3: Đóng nắp seta cố định miệng ống

Bước 4: Phân tích trên máy GC

Dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn được xử lý như mẫu phân tích

3.1.3. Đánh giá các điều kiện của quy trình

a) Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

a 1) Khảo sát khoảng tuyến tính

Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lượng đến giới hạn tuyến tính gọi là khoảng tuyến tính (dynamic range). Khoảng tuyến tính của mỗi nguyên tố phân tích ở mỗi vạch phổ khác nhau là khác nhau. Vạch phổ nào có độ hấp thụ càng nhạy thì khoảng tuyến tính càng hẹp [5], [6].

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của Aceton bằng cách: pha một dãy chuẩn của aceton trong khoảng nồng độ từ 100ppb – 100.000ppb với các mức nồng độ:100; 250; 500; 2500; 5000; 25000; 50000; 75000; 100.000 (ppb). Nước tiểu của người không tiếp xúc với dung môi hữu cơ nói chung và actone nói riêng được sử dụng làm dung dịch pha chất chuẩn. Nước tiểu này trước khi sử dụng đã được phân tích kiểm chứng không chứa Actone. Các mẫu chuẩn được xử lý theo quy trình xử lý mẫu kết hợp cùng các điều kiện tối ưu đã khảo sát thu được kết quả như trong Bảng 3 và Hình 1.

Bảng 3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính aceton     

​

Từ kết quả thực nghiệm ở bảng 3 nhóm nghiên cứu nhận thấy, tín hiệu thu được bắt đầu tang chậm và không tuyến tính từ 75000ppb đến 100.000ppb. Căn cứ vào kết quả thu được chúng tôi xác định được khoảng tuyến tính của aceton trong nước tiểu là  100 – 75000ppb. Vì vậy khi áp dụng quy trình này để phân tích mẫu nếu hàm lượng chất cần phân tích nằm ngoài khoảng tuyến tính thì phải làm giàu mẫu hoặc pha loãng mẫu để phân tích mới đảm bảo được độ chính xác của phương pháp.

a 2) Xây dựng đường chuẩn

* Đường chuẩn

Từ kết quả khảo sát khoảng tuyến tính nhóm nghiên cứu xây dựng đường chuẩn. Phương trình đường chuẩn của phương pháp phân tích aceton trong nước tiểu được chỉ ra ở dưới đây:

Để khẳng định phương pháp không bị mắc sai số hệ thống đề tài tiến hành kiểm tra hệ số a theo tiêu chuẩn thống kê Fisher (chuẩn F) [5], [6].

Nếu Ftính< Fchuẩn (F(0.95; 5; 4)) thì sự sai khác giữa giá trị a và 0 không có ý nghĩa thống kê và ngược lại. Kết quả đánh giá của đề tài cho thấy Ftính = S’2/S2= 4,12; Fchuẩn = F(0,95;5;4) = 5,19, tức là Ftính< Fchuẩn ở phương trình đường chuẩn phân tích aceton trong nước tiểu. Có nghĩa là sự sai khác giữa giá trị a và 0 không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy đề tài xác định phương pháp phân tích trên không mắc sai số hệ thống.

b) Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Đối với sắc ký khí thì việc xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) dựa theo tỷ số tín hiệu/nhiễu đường nên là khá phổ biến [5], [6]. Nhóm nghiên cứu sử dụng cách này để tính LOD, LOQ, bằng cách thêm một lượng chất chuẩn nhỏ dần vào mẫu nước tiểu không phát hiện aceton và tại nồng độ 25ppb thu được tín hiệu cao gấp 3 lần so với tín hiệu đường nền. Như vậy theo phương pháp tính LOD dựa trên tỷ số tín hiệu/nhiễu nhóm nghiên cứu thu được LOD = 25ppb; LOQ = 100 ppb

c) Đánh giá độ chính xác của phương pháp

Độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua độ chụm và độ đúng [5], [6].

–        Độ chụm chỉ mức độ giao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình. 

–        Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.

c 1). Kiểm tra độ chụm

 Trong đó

SD: Độ lệch chuẩn

n: Số lần lặp lại thí nghiệm

xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

  : Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm

CV%: là hệ số biến thiên của phép đo

          Độ chụm thay đổi theo nồng độ các chất phân tích. Nồng độ chất phân tích càng thấp thì kết quả dao động càng nhiều (không chụm) nghĩa là RSD% hay CV% lớn.

Có một số cách khác nhau để kiểm tra độ chụm, tuy nhiên trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi kiểm tra độ chụm bằng cách dùng mẫu thêm chuẩn – pha ba loại mẫu có nồng độ thêm chuẩn gần giá trị ở điểm đầu, điểm giữa, điểm gần cuối của khoảng tuyến tính (tương đương với các mức nồng độ thấp, trung bình, cao). Mỗi mức nồng độ lặp lại 10 lần. Trên cơ sở kết quả các mẫu lặp lại nhóm nghiên cứu đánh giá CV% kết quả thu được như sau:

Bảng 4. Kết quả khảo sát độ chụm của aceton trong nước tiểu

Kết quả khảo sát trình bày trong bảng 3.2 cho thấy CV% ở cả ba điểm (đầu, giữa, cuối) của khoảng tuyến tính đều nằm trong tiêu chuẩn cho phép. Theo tiêu chuẩn đánh giá của AOAC nồng độ chất phân tích từ 1 – 10 mg/L CV% cho phép ≤ 7,3%. CV% của đề tài thu được từ 3,43 – 4,12%, điều này cho thấy phương pháp đạt độ chụm.

c 2) Đánh giá độ đúng của phương pháp

Có nhiều cách để đánh giá độ đúng của phương pháp. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hiệu suất thu hồi, kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi được trình bày ở bảng 3.3 dưới đây:

Bảng 5. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của aceton

Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích aceton trong nước tiểu, hiệu suất thu hồi chúng tôi thu được đạt từ 94% – 101,6%. Nồng độ chất phân tích từ 1 – 7,5 mg/L thì hiệu suất thu hồi (R%) cho phép là từ 80 – 110%, CV% cho phép < 7,3% [6]. Từ kết quả ở bảng trên cho thấy hiệu suất thu hồi của phương pháp đều nằm trong giới hạn cho phép, giá trị CV% lớn nhất đối điểm đầu khoảng tuyến tính là 3,41% các giá trị này đều nhỏ hơn 7,3%. Theo tiêu chuẩn của AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists – Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức) về đánh giá độ thu hồi thì độ thu hồi của phương pháp phân tích aceton là đạt tiêu chuẩn, điều này cho thấy phương pháp đảm bảo độ đúng.

Từ kết quả kiểm tra độ chụm và độ đúng của phương pháp cho thấy các phương pháp phân tích aceton niệu mà đề tài lựa chọn áp dụng đảm bảo độ chính xác. Dựa vào kết quả đánh giá đề tài thu được độ chính xác của phương pháp phân tích aceton niệu là từ 94% trở lên.

d) Đánh giá độ ổn định của phương pháp

          Độ ổn định của phương pháp là khả năng cung cấp các kết quả có độ chính xác chấp nhận được dưới những điều kiện có sự thay đổi về một số điều kiện thực hiện phương pháp như: giữa người A người B, giữa máy A với máy B, giữa điều kiện A với điều kiện B. Đánh giá độ ổn định của phương pháp có thể sử dụng mẫu thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ của khoảng tuyến tính (khoảng đầu, khoảng giữa, khoảng cuối), lặp lại 5 – 10 lần ở mỗi mức nồng độ, đánh giá các nhóm kết quả trong điều kiện khác nhau [5], [6].

          Trong nghiên cứu này để kiểm tra độ ổn định của phương pháp nhóm nghiên cứu tiến hành với mẫu thêm chuẩn khi thay đổi điều kiện về thời gian phân tích. Việc thực hiện phân tích được tiến hành vào 3 tuần liên tiếp nhau, kết quả thu được như sau:

Bảng 6. Thay đổi về điều kiện thời gian đánh giá độ ổn định của quy trình phân tích aceton trong nước tiểu

Thời gian phân tích ở tuần 1, tuần 2, tuần 3; mỗi tuần phân tích 5 lần ở mỗi mức nồng độ

Với điều kiện thay đổi về thời gian, độ ổn định của phương pháp vẫn đảm bảo. Kết quả đánh giá được thể hiện ở bảng 4. Qua 3 tuần khác nhau kết quả mẫu lặp lại ở 3 mức nồng độ của khoảng tuyến tính có CV% nằm trong tiêu chuẩn cho phép của AOAC, đồng thời không có sự khác biệt về kết quả của các khoảng thời gian (3 tuần) đánh giá.

Như vậy, qua việc đánh giá những tiêu chí cần thiết cho một quy trình phân tích: khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, độ ổn định nhóm nghiên cứu nhận thấy quy trình phân tích aceton trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí là đạt yêu cầu của một quy trình phân tích.

Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát quy trình phân tích aceton dựa trên tài liệu tham khảo trước đó cụ thể theo hướng nghiên cứu của Bianca [4] và cộng sự kết hợp phương pháp CDC 8319 có biến đổi cho phù hợp với điều kiện phân tích của phòng thí nghiệm để đưa ra quy trình phân tích tối ưu.

Ưu điểm của quy trình phân tích:

Quy trình phân tích có giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) gần như tốt nhất so với tất cả các quy trình nghiên cứu trước đây. Quy trình phân tích của nhóm nghiên cứu có giới hạn phát hiện (LOD = 0,025mg/L), giới hạn định lượng (LOQ = 0,1mg/L) tốt hơn giới hạn phát hiện của phương pháp CDC 8319 (LOD = 0,6mg/L) và tương đương với phương pháp nghiên cứu của tác giả của các tác giải Oliveira [7] (LOD = 0,1mg/L), Bianca [4].

Thể tích mẫu cần phân tích nhỏ, thuận lợi cho việc lấy mẫu và trong quá trình xử lý mẫu phân tích. Lượng mẫu cần để phân tích của phương pháp là 2ml nước tiểu trong khi phương pháp 8319 sử dụng lượng nước tiểu là 10ml mẫu cho mỗi lần phân tích, với lượng mẫu ít có thuận lợi hơn khi thực hiện lấy mẫu tại cơ sở và trong cả quá trình xử lý mẫu.

Quy trình xử lý mẫu: 2ml mẫu nước tiểu + 2 gam muối NaCl, lắc đều và để vào thiết bị Headspace phân tích. Như đã khảo sát ở mục điều kiện xử lý mẫu thì đây là điều kiện cho tín hiệu phân tích tốt nhất so với việc không cho muối trong quy trình xử lý mẫu. Ở các quy trình nghiên cứu đã tham khảo thì thường không cho muối vào mẫu xử lý, tuy nhiên ở nghiên cứu này nhóm nghiên cứu lại nhận thấy khi cho muối vào mẫu xử lý cho kết quả phân tích tốt hơn là không cho.

          Quy trình này hoàn toàn có thể áp dụng để phân tích aceton trong nước tiểu của người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp để thực hiện giám sát sinh học định kỳ, dự phòng bệnh nghề nghiệp, bảo vệ sức khỏe cho nguòi lao động.

4.  KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

          Đã thử nghiệm thiết lập được quy trình kỹ thuật định lượng nồng độ aceton trong nước tiểu đảm bảo tính ổn định, độ chính xácvới các tiêu chí như sau:

–        Khoảng tuyến tính: (0,025 -75) mg/L.

–        Giới hạn phát hiện: 0,025 mg/L

–        Giới hạn định lượng: 0,1 mg/L

–        Quy trình đảm bảo tính ổn định, độ chính xác trên 94%

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) tương đương và tốt hơn một số tác giả khác đã nghiên cứu, tiết kiệm hóa chất, thời gian phân tích.

 Kiến nghị

      Các phòng thí nghiệm y sinh học cần áp dụng quy trình kỹ thuật xác định aceton trong nước tiểu để giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với aceton.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]     International Labour (2010), List of Occupational Diseases – Identification and Recognition of Occupational Diseases: Criteria for Incorporating Diseases in the ILO List of Occupational Diseases.

[2]     Phạm Thị Kim Nhung (2015), “Nghiên cứu thiết kế, chế tạo và ứng dụng thiết bị xử lý hơi dung môi cho mực in bao bì trong các cơ sở in bao bì vừa và nhỏ”, Báo cáo tổng kết đề tài, Viện Nghiên cứu KHKT Bảo hộ lao động, 2015.

[3]     https://www.cdc.gov/niosh/docs/2003-154/pdfs/8319.pdf.

[4]     S. Bianca, G. Riley, P. Matatiele, and B. Kgarebe (2020), “Simultaneous analysis of acetone, methyl ethyl ketone (MEK), and methyl isobutyl ketone (MIBK) in urine by headspace gas chromatography-flame ionisation detection (HS GC-FID),” Results in Chemistry, vol. 2, p. 100084.

[5]     Tạ Thị Thảo, Giáo trình môn học Thống kê trong hóa phân tích. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia Hà Nôi, 2010.

[6]     Viện kiểm nghiện an toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia (2010), “Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật học”, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, 2010.

[7]     D. Oliveira and M. E. P. B. d. Siqueira, “A simple and rapid method for urinary acetone analysis by headspace/gas chromatography”, Química Nova, vol. 30, pp. 1362-1364, 2007.

Phạm Thị Quyến, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Điềm, Vũ Thị Thanh Phương,

 Đỗ Thị Hà, Nguyễn Hương Trà My

Viện Khoa học An toàn và Vệ sinh lao động

(Nguồn tin: Vnniosh.vn)