Xây dựng quy trình kỹ thuật phân tích định lượng HEXAMETHYLEN DIAMIN (HDA) – sản phẩm chuyển hóa của HEXAMETHYLENE DIISOCYANATE (HDI) trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MSMS)

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Hexamethylene diisocyanate (HDI) là nguyên nhân chính gây bệnh hen phế quản nghề nghiệp [1]. Theo tổ chức lao động thế giới (ILO) bệnh gây nên bởi isocyanate là bệnh nghề nghiệp đã được quy định. Ở nước ta đã ban hành Quyết định số 27/QĐ-BYT ngày 21/9/2006 [2] quy định bện hen phế quản nghề nghiệp trong đó có tác nhân là isocyanate. Hội nghị các nhà vệ sinh công nghiệp của chính phủ Hoa Kỳ (ACGIH) của Mỹ và nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã đề xuất chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với 1,6-Hexamethylen diisocyanate (HDI) là chỉ số 1,6-Hexamethyllen diamine (HDA) niệu ≤15 µg/g creatinin (mẫu nước tiểu cuối ca làm việc) [3]

Tại Việt Nam chưa có quy định sử dụng chỉ số giám sát sinh học cho người lao động tiếp xúc nghề nghiệp với 1,6-Hexamethylen diisocyanate do chưa có quy trình phân tích định lượng các chỉ số giám sát sinh học. Để góp phần bảo vệ sức khỏe người lao động có tiếp xúc với HDI cần phải xây dựng quy trình phân tích định lượng chỉ số giám sát sinh học của chất này. Vì vậy cần nghiên cứu “Xây dựng quy trình kỹ thuật phân tích định lượng hexamethylen diamin (HDA) – sản phẩm chuyển hóa của hexamethylene diisocyanate (HDI) trong nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MSMS)” nhằm xây dựng được quy trình phân tích HDA trong nước tiểu bằng sắc ký lỏng khối phổ, góp phần đề xuất làm chỉ số giám sát sinh học với người lao động tiếp xúc với 1,6 Hexamethylene diisocyanate

2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. 1. Đối tượng nghiên cứu

    Quy trình phân tích Hexamethylen diamin (HDA) niệu – chất chuyển hóa của Hexamethylene diisocyanate (HDI) trong nước tiểu của người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp.

2. 2. Phương pháp nghiên cứu

    Tiến hành theo phương pháp nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm của viện Khoa học ATVASĐ bằng cách ứng dụng phương pháp phân tích theo tác giả Maggy Lépine [4] và Deepak Bhandari [5] 

2. 3. Phương pháp kỹ thuật thực hiện

 2.3.1. Lấy mẫu ngoài hiện trường          

Lấy mẫu nước tiểu bãi, cuối ca làm việc của người lao động tại nơi làm việc, thu từ 5-10 ml nước tiểu bãi vào ống nhựa thể tích 15 ml có nắp đậy, loại chịu được điều kiện âm sâu (-80^oC). Bảo quản lạnh tại hiện trường, khi đưa về phòng thí nghiệm được bảo quản âm sâu trước khi phân tích theo “Hướng dẫn lấy mẫu, đóng gói, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm bệnh truyền nhiễm” của Cục y tế dự phòng.

2.3.2. Xây dựng quy trình

Thử nghiệm ứng dụng phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ với các điều kiện:

• Thiết bị: Sắc ký lỏng ba lần tứ cực LC/MSMS mã HPLC 1290/ MSD6430B, tủ âm sâu-86^oC, Máy thổi khô khí Nito, thiết bị gia nhiệt, máy ly tâm lạnh, cân phân tích độ chính xác 0,00001mg

• Dụng cụ: Bình định mức, pipet, Cột ACE C18 2.1 × 100 mm, kích thước hạt 2 µm

• Hóa chất: Hóa chất sử dụng  trong đề tài của hãng Sigma, Merck đảm bảo độ tinh khiết để phân tích lượng vết: Hexamethylen diamin  (HDA), N,N′-Diacetyl-1,6-hexanediamine (HAD-di-Ac), NH₄OH (25%), NaOH, H₂SO_4, Acid formic, Sodium tetraborate decahydrate, Acetonnitrin, Axit acetic….

• Phương pháp phân tích được xây dựng theo tác giả Maggy Lépine [3] và Deepak Bhandari [4]

2.3.3 Xác định sản phẩm chuyển hóa Hexamethylen diamin (HDA) niệu

Xác định bằng quy trình xây dựng được trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS của Agilent

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Xây dựng quy trình

3.1.1. Các thông số cài đặt trên LC/MSMS

Để đảm bảo phát hiện và định lượng được chất phân tích đề tài khảo sát các điều kiện tối ưu nhất cho các thông số trên LC/MSMS như sau:

* Điều kiện trên LC:

– Tỉ lệ dung môi: A: 83%; B: 17% 

– Tốc độ dòng (flow): 0,3 ml/Phút

– Thời gian chạy mẫu: 6,5 phút

– Thể tích bơm mẫu: 10 µl

 – Nhiệt độ cột bên trái và bên phải: 35⁰C

– Nhiệt độ buồng tiêm mẫu:4⁰C

 * Điều kiện trên MS:

• Nguồn tạo ion: ESI
• Năng lượng ion hóa: 70eV
• Chế độ chạy: MRM
• Năng lượng bắn phá (E): 15
• Phổ cho HDA m/z: 201.1/100.1

3.1.2. Xử lý mẫu

    – Mẫu nước tiểu 400 µl + 400 µl H₂SO₄ 3 M, trộn đều, làm nóng ở nhiệt độ 80^oC trong vòng 4 giờ sử dụng bộ điều nhiệt. Làm lạnh về nhiệt độ phòng thêm 400 µl NaOH 5 N, ly tâm ở tốc độ 14,500 rpm trong 3 phút được dung dịch A

    – Chiết dung dịch A qua cột chiết pha rắn MCX. Cột chiết pha rắn được hoạt hóa bằng 1 ml methanol, rửa cột với 1 ml H₂O, load mẫu (dung dịch A) qua cột, rửa tạp bằng 1 ml acid formic 2% trong nước, rửa giải bằng 0,5 ml (2 lần) dung dịch NH₄OH 10%. Làm khô dịch chiết bằng máy thổi khí Nito ở nhiệt độ 60^oC. Hòa cặn bằng 396 μL dung dịch đệm borate (pH 8.5) + 4 μL anhydrit axetic. Lọc qua màng lọc mẫu 0,2µm. Bơm 10 µl vào LC-MSMS

3.1.3 Đánh giá các điều kiện của quy trình

3.1.3.1 Khảo sát thời gian thủy phân mẫu

Các chất liên hợp và chất chuyển hóa được acetyl hóa hình thành trong cơ thể sống sau tiếp xúc với HDI được loại bỏ trong nước tiểu. Các amin tự do được giải phóng sau khi thủy phân bằng axit đóng vai trò là dấu ấn sinh học sinh học để xác định mức độ phơi nhiễm HDI. Hiệu suất thủy phân được đánh giá bằng cách sử dụng các chất chuyển hóa được tìm thấy trong nước tiểu sau khi tiếp xúc với HDI là diacetyl-HAD. Thời gian thủy phân từ 1h-24 h được khảo sát. 

                                           Hình 1: Thời gian thủy phân mẫu

Ở thời gian thủy phân mẫu 4 h cho hiệu suất thu hồi đạt 91,9 %. Khi tăng thời gian thủy phân thì nồng độ HDA được chuyển hóa trong mẫu cũng tăng không đáng kể. Do vậy đề tài chọn thời gian thủy phân mẫu là 4h  

3.1.3.2 Khảo sát dung môi rửa giải

Sau khi thủy phân bằng axit, pH của mẫu được điều chỉnh đến ~ 1. Dựa trên giá trị pK a ~ 10,5, chất phân tích có thể được giữ lại bằng cột chiết pha rắn SPE trao đổi cation mạnh. Cần dung môi rửa giải có pH thích hợp để trung hòa và rửa giải chất phân tích với hiệu suất tốt nhất. Kết quả khảo sát mẫu được thêm chuẩn ở mức 40 µg/l được rửa giải bằng các dung môi khác nhau: NH₄OH 1%, NH₄OH 5%, NH₄OH 10%, NH₄OH 15%, NH₄OH 20% trong MeOH  . Kết quả thu được theo bảng sau:

Bảng 1.  Kết quả khảo sát dung môi rửa giải đối với HAD – di-Ac

Kết quả thu được từ bảng 1 cho thấy ở nồng độ NH₄OH thấp 1% HAD không được chiết ra khỏi cột, tăng nồng độ NH₄OH thì chất phân tích được chiết ra khỏi cột, ở nồng độ NH₄OH 10% mẫu được chiết đạt hiệu suất thu hồi tốt 88,2 % 

3.1.3.3.  Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Lập đường chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phương pháp phân tích. Từ đường chuẩn ta có thể biết được khoảng tuyến tính của chất phân tích, từ đó đưa nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Đề tài tiến khảo sát khoảng tuyến tính của HAD – di-Ac với nồng độ pha một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,5 µg/l đến 200 µg/l từ dung dịch chuẩn gốc và chuẩn trung gian. Các dung dịch chuẩn được pha trong nước deion. Sau đó đem đo ở các điều kiện như đã khảo sát ở trên. Từ kết quả thu được đề tài nhận thấy khoảng tuyến tính của HDA trong nước tiểu từ 0,5-75 µg/L. Ở nồng độ 100 µg/L trở lên thì tín hiệu thu được không tỷ lệ tuyến tính với nồng độ.

Hình 2. Pic  chuẩn của HDA –di-Ac

Hình 3. Đường chuẩn của HDA –di-Ac

 Bảng 2. Khoảng làm việc và độ chệch

 Theo kết quả phân tích trên phần mềm Minitab 18 ta có: a= 4951  ; b= 241, S_a =31; S_b=1088. Tra bảng  giá trị chuẩn t với bậc tự do f=6, độ tin cậy 95% có t=2,447 nên phương trình hồi qui của đường chuẩn trên sẽ có dạng:

y = (241± 2662)  + (4951±749) x

Kết quả cho cho thấy trong khoảng nồng độ từ 0,5 µg/l đến 75 µg/l, nồng độ và diện tích pic có mối quan hệ tuyến tính đối với HDA, với hệ số tương quan hồi quy (R² > 0,99), độ chính xác của tất cả các điểm đáp ứng yêu cầu, giá trị độ chệch từng điểm chuẩn có giá trị nằm trong khoảng ±15%. Vì vậy, khoảng nồng độ từ 0,5 µg/l đến 75 µg/l được nhóm nghiên cứu chọn là khoảng định lượng.

3.1.3.4. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

     Giới hạn phát hiện LOD được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. 

     Giới hạn định lượng LOQ được xem là nồng độ thấp nhất mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Theo lí thuyết thống kê hóa phân tích thì LOQ = 3,33 LOD. 

Để xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ, tiến hành thêm chuẩn ở nồng độ thấp trên nền mẫu thực không chứa chất phân tích cho tới khi thu được chiều cao chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền (S/N = 3), đo lặp lại 10 lần

Ở nồng độ 0,1 µg/L tỷ lệ S/N cao gấp 3,2 lần so với tín hiệu đường nền. Như vậy giới hạn phát hiện của phương pháp 0,1 µg/L, giới hạn định lượng của phương pháp là 0,3 µg/l. Với giới hạn định lượng thu được, phương pháp có đủ hiệu năng để có thể phân tích các mẫu nước tiểu với độ nhạy cao

 3.1.3.5  Đánh giá độ chính xác của phương pháp

Theo tiêu chuẩn quốc tế (ISO – 5725 1 – 6:1994) và tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 6910 1- 6:2005) độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua độ chụm và độ đúng [6]. 

• Độ chụm chỉ mức độ giao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình.  
• Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.

Độ chụm của phương pháp được xác định theo các đại lượng SD và CV. Công thức tính của đại lượng này là: 

Độ lệch chuẩn: 

Trong đó:      

SD: Độ lệch chuẩn

          x_i : Nồng độ chất nghiên cứu ở thí nghiệm thứ i (µg/L);

          : Nồng độ trung bình của chất nghiên cứu với n lần thí nghiệm lặp lại (µg/L);

         N: Số lần thí nghiệm được lặp lại

Hệ số biến thiên:

Trong đó:       CV: hệ số biến thiên (%);

                      S: Độ lệch chuẩn;

                        : Nồng độ trung bình chất nghiên cứu (µg/L)

            Độ chụm thay đổi theo nồng độ các chất phân tích. Nồng độ chất phân tích càng thấp thì kết quả dao động càng nhiều (không chụm) nghĩa là RSD% hay CV% lớn.

Có một số cách khác nhau để kiểm tra độ chụm. Tuy nhiên trong khuôn khổ đề tài nhóm nghiên cứu kiểm tra độ chụm bằng cách dùng mẫu thử thêm chuẩn – pha ba loại mẫu có nồng độ thêm chuẩn bằng giá trị ở điểm đầu, điểm giữa, điểm gần cuối của khoảng tuyến tính (tương đương với các mức nồng độ thấp, trung bình, cao). Mỗi mức nồng độ lặp lại 10 lần. Trên cơ sở kết quả các mẫu lặp lại nhóm nghiên cứu đánh giá độ thu hồi theo công thức sau:

Trong đó: R%: Độ thu hồi

C_m+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

C_m: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

C_c: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần lặp lại.

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của mẫu HDA trong nước tiểu

Kết quả khảo sát cho thấy CV% biến động tuân theo định luật phân bố Gauuss. Với mẫu điểm đầu sai số 2,2 %, điểm cuối sai số 0,7%, điểm giữa sai số 1.1%. Theo tiêu chuẩn đánh giá của AOAC nồng độ chất phân tích từ 1-100 µg/L, CV% cho phép là < 21% [6]. Nên những sai số ở trên cả điểm đầu, điểm cuối hay điểm giữa đều là những sai số nhỏ và chấp nhận được. Điều đó chứng tỏ độ chụm của phương pháp đạt yêu cầu.

Theo tiêu chuẩn đánh giá của AOAC nồng độ chất phân tích từ 1-100 µg/L độ thu hồi cho phép từ 60-115%. Kết quả ở bẳng 3 cho thấy độ thu hồi của quy trình phân tích tốt, đạt được từ 86,7%- 101,6 % ở cả mức nồng độ thấp, trung bình và cao

Từ quy trình trên đề tài có đề tài có một số nhận xét như sau:

So với kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy quy trình của đề tài có khoảng tuyến tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đương hoặc tốt hơn một số quy trình phân tích của một số tác giả khác. Cụ thể so sánh với phương pháp của Deepak Bhandari và cộng sự [5] phân tích trên UPLC-MS/MS có LOD = 0,15 µg/l cao hơn LOD của đề tài (0,1 µg/l), khoảng tuyến tính 0,32–32,0 µg/l hẹp hơn so với khoảng tuyến tính mà đề tài thu được (0,5-75,0 µg/l). So với phương pháp của tác giả Maggy Lépine và cộng sự [4] phân tích trên thiết bị UHPLC-MS/MS, LOD của phương pháp này là 0,58 µg/l cao hơn LOD của đề tài xây dựng được (0,1 µg/l). Độ thu hồi theo phương pháp của Maggy Lépine trung bình 96,6 ± 7,1 % tương đương so với kết quả của đề tài (86,7%- 101,6 %)

3.2. Ứng dụng quy trình phân tích 

       Đề tài lấy 210 mẫu nước tiểu của người lao động sơn làm việc tại gara, công ty sản xuất ô tô tiếp xúc trực tiếp với HAD, sử dụng quy trình xây dựng được phân tích cho kết quả như trong bảng 4

Bảng 4: Kết quả phân tích HDA trong nước tiểu

GHĐL: Giới hạn định lượng

Kết quả từ bảng 4 cho thấy: trong 210 đối tượng tiếp xúc trực tiếp với HDI được lấy nước tiểu xét nghiệm nồng độ HDA, nồng độ HDA thu được từ 0,24-47,63 µg/g creatinine. Có 4 đối tượng có nồng độ HDA >15 µg/g creatinine, chiếm tỉ lệ 1,9 % 

4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận 

Xây dựng được quy trình kỹ thuật phân tích định lượng HDA bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ với những thông số: Khoảng tuyến tính 0,5-75 µg/L; giới hạn phát hiện 0,1 µg/L; giới hạn định lượng 0,3 µg/L; hiệu suất thu hồi đạt từ 86,7%- 101,6 % ở cả mức nồng độ thấp trung bình và cao, độ lệch chuẩn tương đối <5% đáp ứng yêu cầu theo AOAC. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đương với nghiên cứu của tác giả Deepak Bhandari và thấp hơn so với tác giả Maggy Lépine

Áp dụng quy trình xây dựng được phân tích nồng độ HDA 210 mẫu nước tiểu của đối tượng tiếp xúc với HDI, trong đó có 1,9 % đối tượng có nồng độ HAD vượt giới hạn cho phép 

4.2. Kiến nghị 

Áp dụng rộng rãi kỹ thuật xác định HDA trong nước tiểu để làm công cụ giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với HDI

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Agency for toxic Substances & diease Registry (1998). Toxicological Profile for Hexamethylene Diisocyanate (HDI), U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES“.

2. Bộ Y tế (2016), “Quyết định số 27/QĐ-BYT ngày 21 tháng 9 năm 2006 về việc Ban hành bổ sung 4 bệnh nghề nghiệp vào danh mục các loại bệnh nghề nghiệp được bảo hiểm“.

3. The American Conference of Governmental Industrial Hygienists (2014), Documentation of the Threshold Limit Vales and Biological Exposure Indices, 7th edition. ACGIH, Cincinnati OH”, ACGIH, Cincinnati OH.

4. Maggy Lépine1,2 & Lekha Sleno1 & Jacques Lesage1 & Sébastien Gagné2. (2019), “A validated UPLC-MS/MS method for the determination of aliphatic and aromatic isocyanate exposure in human urine”, Analytical and Bioanalytical Chemistry, pp. 753-762

5.         Deepak Bhandari⁎ , Brett A. Bowman, Anish B. Patel, David M. Chambers, Víctor R. De Jesús, Benjamin C. Bloun. (2018), “UPLC-ESI-MS/MS method for the quantitative measurement of aliphatic diamines, trimethylamine N-oxide, and β-methylamino-L-alanine in human”, Journal of Chromatography B, Vol 1083, pp 86-92. 

6.          Viện kiểm nghiện an toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia (2010), “Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật học”, NXB Khoa học và Kỹ Thuật.

CN. Tống Thị Ngân, BS Mai Ngọc Thanh

Viện KH An toàn và vệ sinh lao động

(Nguồn tin: Vnniosh.vn)